抗呋喃它酮代謝衍生物-隱孔雀石綠雙特異性單克隆抗體的制備及分析特性研究.pdf

1、呋喃它酮（FA）和孔雀石綠（MG）屬于我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中禁止使用的獸藥，這兩種藥物在動(dòng)物體內(nèi)分別被代謝為5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷酮（AMOZ）和隱孔雀石綠（LMG）。目前，已有針對(duì) AMOZ、LMG或它們衍生物的多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體的報(bào)道。FA和MG是水產(chǎn)品中經(jīng)常檢測(cè)的指標(biāo)，制備針對(duì)2種藥物的雙特異性抗體能同時(shí)識(shí)別和結(jié)合2種對(duì)象，并用于建立多殘留檢測(cè)方法，顯著提高現(xiàn)有單殘留檢測(cè)法的簡(jiǎn)便性和快捷性。目前尚未見(jiàn)抗A

2、MOZ（或AMOZ衍生物）和LMG的雙特異性抗體的研究報(bào)道。本文采用藥物誘變方法構(gòu)建了制備四體瘤的雜交體系，利用雜交–雜交瘤技術(shù)制備得到抗AMOZ衍生物和LMG的雙特異性單克隆抗體（BsMAb），并建立了 AMOZ-MG/LMG多殘留 ic-ELISA分析方法和AMOZ-MG/LMG殘留總量ic-ELISA分析方法，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）酶缺陷型雜交瘤細(xì)胞株的誘導(dǎo)篩選
　　分別利用梯度濃度的8-氮鳥(niǎo)嘌呤（8-AG）和

3、5-溴尿苷（5-BrdU）對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選獲得一株分泌抗 AMOZ衍生物（3-NPAMOZ）單克隆抗體的次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）缺陷型雜交瘤細(xì)胞株3-NPAMOZ-HGPRT－和一株分泌抗LMG單克隆抗體的胸苷激酶（TK）缺陷型雜交瘤細(xì)胞株LMG-TK－。采用ic-ELSIA法對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明誘導(dǎo)前后無(wú)明顯差異。
　?。?）BsMAb的篩選制備
　　采用雜交-雜交瘤技術(shù)

4、將兩種酶缺陷型雜交瘤細(xì)胞3-NPAMOZ-HGPRT－和LMG-TK－進(jìn)行融合，篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗AMOZ衍生物和LMG雙特異性單克隆抗體的四體雜交瘤細(xì)胞4B10-5F1。采用小鼠腹腔誘生的方法獲得含BsMAb的腹水，并采用辛酸-硫酸銨法和離子交換柱層析法依次分離純化，純化后的BsMAb純度達(dá)到電泳純。分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法、單克隆抗體亞型測(cè)定試劑盒及非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法對(duì)BsMAb的分子量、抗體亞型和

5、親和力進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明BsMAb分子量約為150 kDa，抗體亞型為IgG1型。BsMAb對(duì)AMOZ衍生物、LMG的親和力常數(shù)分別為4.67×108 L/mol和3.60×108 L/mol。
　　（3）AMOZ-MG/LMG多殘留ic-ELISA方法的建立
　　建立了AMOZ-MG/LMG多殘留ic-ELISA方法，優(yōu)化了包被原濃度、BsMAb稀釋倍數(shù)、BsMAb稀釋液、一抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)二抗反應(yīng)

6、時(shí)間、藥物稀釋液和藥物稀釋液pH等檢測(cè)條件。方法對(duì)AMOZ（以AMOZ的3-硝基苯甲醛衍生物3-NPAMOZ計(jì)，下同）的檢測(cè)限為0.2 ng/mL，IC50為1.7 ng/mL，線性檢測(cè)范圍為0.4-8.3 ng/mL。方法對(duì)LMG的檢測(cè)限為4.8 ng/mL，IC50為45.3 ng/mL，線性檢測(cè)范圍為7.0-291.7 ng/mL。除與呋喃它酮有32.6％的交叉反應(yīng)率外，與其它類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。檢測(cè)草魚(yú)和羅非魚(yú)中AMOZ的添加

7、回收率為72.4%-101.0%，變異系數(shù)均小于15%。ic-ELISA檢測(cè)結(jié)果和HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.97以上。檢測(cè)草魚(yú)和羅非魚(yú)中MG、LMG及MG-LMG等量混合物的添加回收率為75.0%-108.0%，變異系數(shù)均小于15%。ic-ELISA檢測(cè)結(jié)果和HPLC-FLD檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.95以上。該多殘留ic-ELISA方法可用于水產(chǎn)品中AMOZ、MG和LMG的同時(shí)檢測(cè)。
　?。?）AMOZ-

8、MG/LMG殘留總量ic-ELISA方法的建立
　　建立了 AMOZ-MG/LMG殘留總量檢測(cè)的ic-ELISA方法，優(yōu)化了共包被濃度、BsMAb稀釋倍數(shù)、不同3-NPAMOZ和LMG配比的標(biāo)準(zhǔn)曲線、BsMAb稀釋液、一抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間、藥物稀釋液和藥物稀釋液pH等檢測(cè)條件。方法建立中AMOZ被衍生化生成3-NPAMOZ，MG被還原生成LMG。該方法檢測(cè)3-NPAMOZ和LMG殘留總量的IC50為

9、1.8 ng/mL，檢測(cè)限為0.07 ng/mL，線性檢測(cè)范圍為0.2-14.5 ng/mL。除與呋喃它酮、3-NPAMOZ分別有32.8%和146.3%的交叉反應(yīng)率外，與其它類似物無(wú)明顯的交叉反應(yīng)。草魚(yú)中不同配比 AMOZ-MG、AMOZ-LMG和AMOZ-MG/LMG混合藥物的添加回收率范圍為72.2%-107.0%，變異系數(shù)小于15%。ic-ELISA檢測(cè)結(jié)果和HPLC檢測(cè)結(jié)果（HPLC-FLD和HPLC-MS/MS）線性相關(guān)系數(shù)