抗人VEGF及OPN雙特異性抗體的制備及生物學(xué)活性研究.pdf

1、血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有著重要作用，使腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲。新生血管的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)復(fù)雜的多因子和多信號(hào)傳導(dǎo)過程的結(jié)果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。VEGF能與細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，通過激活酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮功能，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)血管形成，促進(jìn)腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，并提高血管通

2、透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞內(nèi)、皮細(xì)胞侵潤(rùn)，有利于腫瘤基質(zhì)形成和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入新生血管，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。大量結(jié)果證明，VEGF在促進(jìn)腫瘤血管生成過程中起重要作用，阻斷VEGF被認(rèn)為是當(dāng)前最為有效的抗腫瘤治療方法之一。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)多因素多機(jī)制多種因子參與的過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種癌組織中均可發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)表達(dá)增加。進(jìn)一步研究

3、發(fā)現(xiàn)，人骨橋蛋白是一種含314個(gè)氨基酸殘基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和遷移等過程，且OPN受體和血管重建關(guān)系密切，整合素αvβ3和OPN的共同表達(dá)可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移。Hirama等證實(shí)，OPN在腫瘤生長(zhǎng)過程中新生血管形成的機(jī)制起到了重要的作用。因此，抑制OPN的活性可阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 大量研究表明，VEGF和OPN在血管生成的機(jī)制中有很大關(guān)聯(lián)．VEGF可誘

4、導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞編碼αvβ3的mRNA增加，使新生血管表面有αvβ3高水平表達(dá)．而VEGF同樣也可以誘導(dǎo)編碼OPN的mRNA增加，而OPN是αvβ3的配體，二者相互作用可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移．VEGF可以迅速增加微血管的通透性，導(dǎo)致包括凝血因子在內(nèi)的血漿蛋白濃度增高，上調(diào)一些蛋白分子的表達(dá)，如生長(zhǎng)因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受體，易于激活外源性凝血途徑，產(chǎn)生凝血酶，促進(jìn)OPN的酶切。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未經(jīng)酶切者強(qiáng)

5、，能大大提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移速度，促進(jìn)微血管的生成。此外，OPN還能激活Brk/NF-nB/ATF-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，并促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成，加快腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。所以，如果能阻斷OPN，不但可以抑制其促腫瘤血管生成的作用，還可以下調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而阻止VEGF介導(dǎo)的腫瘤新生血管的形成。 由上可知，如果能同時(shí)阻斷VEGF和OPN，不但可以抑制VEGF的促血管生成的功能和

6、OPN的促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，還將降低內(nèi)源性VEGF的表達(dá)，進(jìn)而可進(jìn)一步抑制VEGF的促血管生成作用，并減少其介導(dǎo)的OPN的酶切，從而抑制OPN的促進(jìn)血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，故可能會(huì)比單獨(dú)阻斷VEGF或OPN有更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的協(xié)同作用，對(duì)腫瘤的治療將具有重要意義。 Genentech公司的抗癌新藥Avastin(抗VEGF人源化抗體)已于2004年2月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，并有望用于其它腫

7、瘤，包括非小細(xì)胞肺癌和腎癌的治療。我們前期的研究得到一個(gè)特異性抗OPN的人源化抗體hu1A12，該人源化抗體，可特異性阻斷OPN，在體內(nèi)外有明顯的抗腫瘤活性。若將Avastin和hu1A12聯(lián)合應(yīng)用，可同時(shí)阻斷VEGF和OPN，進(jìn)一步提高抗腫瘤治療效果。但是，單抗聯(lián)合應(yīng)用具有很多限制。首先，臨床上同時(shí)應(yīng)用兩種抗體的的安全性和效果至今未有詳盡的報(bào)道，可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)；另外，聯(lián)合應(yīng)用兩種抗體也存在調(diào)節(jié)障礙和造價(jià)太高的缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。

8、 采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的雙特性抗體可以同時(shí)阻斷兩個(gè)靶點(diǎn)。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的可同時(shí)阻斷VEGF和OPN的雙可變區(qū)的人源化抗體DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)。我們構(gòu)建的該人源化DVD-Ig AVOPN來源于兩個(gè)特異的人源化抗體，即抗VEGF的人源化單克隆抗體Avastin和抗OPN的人源化單抗hu1A12。將Avastin的重鏈可變區(qū)通過AS

9、TKGP構(gòu)成的linker與hu1A12的重鏈可變區(qū)的N末端串聯(lián)在一起構(gòu)成了AVOPN的重鏈可變區(qū)，然后與抗體的Fc段連接，構(gòu)建出AVOPN的重鏈基因；將Avastin的輕鏈可變區(qū)通過TVAAP構(gòu)成的linker與hu1A12的輕鏈可變區(qū)的N末端串聯(lián)在一起構(gòu)成了AVOPN的輕鏈可變區(qū)，然后用overlap的方法連接上CK，構(gòu)建出AVOPN的輕鏈基因。將上述輕重鏈基因分別裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，weste

10、rnblot檢測(cè)正確表達(dá)后，挑選出穩(wěn)定高表達(dá)的克隆大量擴(kuò)增表達(dá)，收集培養(yǎng)上清以rProteinA凝膠層析柱純化，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白，鑒定了蛋白分子量與理論分子量相符，純度可達(dá)90％。ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該DVD-Ig可同時(shí)結(jié)合VEGF和OPN，且與VEGF的親合力和Avstin相似，與OPN的親合力和hu1A12相似，說明該DVD-Ig結(jié)構(gòu)既可有原來兩種抗體的特異性，又保留了母源抗體的親合力。 用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)

11、、劃痕修復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)該DVD-IgAVOPN對(duì)VEGF和OPN的阻斷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AVOPN可有效地抑制VEGF和OPN介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及劃痕修復(fù)，與Avastin和hu1A12聯(lián)合使用達(dá)到近似效果。右脅側(cè)接種LM3腫瘤細(xì)胞的裸鼠用DVD-Ig AVOPN進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DVD-IgAVOPN具有比Avastin和hu1A12單獨(dú)使用有更好的抑制血管生成作用，可顯著抑制腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移，與兩倍劑量的Avastin和hu