抗人CD86雙價抗體的研制及生物學活性研究.pdf

1、B7分子是表達在抗原遞呈細胞表面的協(xié)同刺激分子，其中 CD86(又稱 B7-2)和CD80(又稱B7-1)為B7分子家族重要成員，為T細胞活化提供重要的協(xié)同刺激信號。T細胞的活化不但需要TCR識別抗原肽段所介導的特異性信號，還需要CD28分子結(jié)合抗原提呈細胞表面B7分子所提供的協(xié)同刺激信號，從而誘導T細胞增殖并分化，發(fā)揮正常免疫防御及調(diào)節(jié)功能。
　　有研究表明，B系淋巴瘤細胞及多發(fā)性骨髓瘤細胞表面同時高表達CD86與CD28，在細

2、胞間形成交互活化信號，導致此類腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移；進一步研究表明，抗體封閉該腫瘤細胞表面CD86分子可以有效遏制此細胞的增殖。本研究在已獲得穩(wěn)定分泌抗人CD86單克隆抗體雜交瘤的基礎上，研制抗人CD86雙價抗體，并研究其對協(xié)同刺激信號的阻斷作用及對表達CD86的腫瘤細胞體內(nèi)、外增殖的影響。
　　第一部分，抗人CD86雙價抗體真核表達載體的構(gòu)建及表達
　　【目的】：構(gòu)建重組抗人CD86雙價抗體真核表達載體，轉(zhuǎn)染至CHO細胞中

3、表達，分離培養(yǎng)上清，純化CD86-diabody并鑒定其特性。
　　【方法】：從分泌抗人CD86鼠源抗體的雜交瘤1D1中克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因VH及VL。通過SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建VH-(GGGGS)-VL雙價抗體基因，再整合到真核表達載體pIRES2-EGFP中，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細胞，F(xiàn)CM篩選G418加壓培養(yǎng)的陽性細胞克隆。大量培養(yǎng)該CHO細胞，IMAC法純化細胞培養(yǎng)上清得到抗體，再用BCA法測定抗體濃度，最后通過SD

4、S-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色鑒定抗體雙價性。
　　【結(jié)果】：構(gòu)建了抗人CD86-diabody真核表達載體，篩選出一株具有穩(wěn)定分泌抗人 CD86-diabody能力的 CHO細胞株，細胞培養(yǎng)上清中抗體純品的得率為5.24mg/L，雙價抗體分子量約為56kDa。
　　【結(jié)論】構(gòu)建了抗人CD86-diabody真核表達載體，在CHO細胞中成功表達，獲得了穩(wěn)定分泌抗人CD86-diabody的CHO細胞株，大量培養(yǎng)并純化得到了

5、雙價抗體分子。
　　第二部分，抗人CD86雙價抗體的生物活性研究
　　【目的】：研究CD86-diabody對細胞表面CD86分子的特異性識別及介導的生物學活性。
　　【方法】：通過免疫熒光技術(shù)分析 CD86-diabody對人 B系淋巴瘤細胞株 Raji及Daudi膜型CD86分子的陽性結(jié)合率，并與抗CD86鼠源親本抗體及單鏈抗體比較抗原結(jié)合特性；通過單向混合淋巴細胞反應研究 CD86-diabody對 CD86-C

6、D28協(xié)同刺激信號的阻斷作用；將CD86-diabody加入到Raji細胞培養(yǎng)體系中進行共培養(yǎng)，分析其對Raji細胞體外增殖的影響，并通過流式細胞術(shù)研究其對Raji細胞凋亡的誘導作用；Raji細胞經(jīng)CD86-diabody孵育后，接種BALB/c裸鼠，觀察其對腫瘤細胞體內(nèi)成瘤的影響。
　　【結(jié)果】：CD86-diabody與 Raji及 Daudi細胞結(jié)合陽性率分別為77.2%及70.6%；競爭結(jié)合實驗結(jié)果顯示，CD86-diab

7、ody對親本抗體及CD86-scFv與CD86結(jié)合抑制率為69.2%與56.7%；CD86-diabody阻斷協(xié)同刺激信號后，對淋巴細胞增殖的抑制率為62.9%；CD86-diabody孵育后，Raji細胞體外增殖率下降了37%，凋亡率增加了17.0%；Raji細胞經(jīng)CD86-diabody封閉后接種裸鼠，動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤形成延遲6-8天，腫瘤體積較對照組相比小約30%。
　　【結(jié)論】：研制的抗人CD86-diabody能特異性結(jié)