抗KDR基因工程抗體的研制及生物學(xué)活性研究.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文抗KDR基因工程抗體的研制及生物學(xué)活性研究姓名：李容申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：分子藥理學(xué)指導(dǎo)教師：楊純正朱禎平20040501中∞匱攀科學(xué)m中l(wèi)協(xié)p醫(yī)科太掌博女目Rt畢mi達(dá)量可達(dá)2mg／L培養(yǎng)基。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)抗Etag親和層析純化，獲得純度在90％以上的KDR胞外III區(qū)融合蛋白。進(jìn)一步使用純化可溶性KDR胞外III區(qū)融合蛋白作為抗原免疫小鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)制各單克隆抗體。經(jīng)過(guò)多輪交叉篩選，我們最終獲得了一株

2、能穩(wěn)定分泌抗KDR胞外III區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株YaomlD3。體外生物活性研究表明，該單克隆抗體不僅可與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原及細(xì)胞表面表達(dá)的KDR結(jié)合，還可競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結(jié)合，阻斷VEGF。刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面KDR酪氨酸激酶受體磷酸化，并可顯著抑制VEGF。；誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外三維膠原模型上內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，具有潛在的抗腫瘤血管新生臨床應(yīng)用價(jià)值。為克服鼠源

3、性單抗自身固有的一些缺陷，我們對(duì)其進(jìn)行了基因工程抗體的改造。通過(guò)采用通用簡(jiǎn)并性引物，成功克隆了抗KDR單克隆抗體YaomlD3輕、重鏈可變區(qū)基因，并采用(Gly。Ser)。柔性連接短肽將重、輕鏈可變區(qū)基因前后連接為單鏈抗體片段，在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性、純化、透析復(fù)性，最終得到能特異性與KDR表達(dá)陽(yáng)性的HUVEC細(xì)胞結(jié)合的活性產(chǎn)物。ELISA及免疫熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該單鏈抗體保留了親本單克隆抗體的特異性

4、結(jié)合活性，并可競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結(jié)合，無(wú)論是作為靶向診斷治療的載體還是作為雙功能抗體的一臂，均具有廣泛的應(yīng)用前景。HIT3a是我所研制的鼠源性抗CD3單克隆抗體，并已經(jīng)過(guò)國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組的正式命名。在成功構(gòu)建、表達(dá)抗KDR單鏈抗體的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步克隆了抗CD3單抗HIT3a和抗KDR單抗YcomlD3輕、重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建抗KDR／抗CB3Diabody微型雙功能抗體，并在大腸桿菌