抗Met基因工程抗體的親和力成熟與特性研究.pdf

1、本研究以Met為靶標(biāo)、以噬菌體抗體展示技術(shù)為平臺(tái)，通過(guò)抗體重鏈與輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR-H和CDR-L)部分基因的有限突變與隨機(jī)突變，結(jié)合抗體框架區(qū)個(gè)別氨基酸的改變，構(gòu)建抗Met單鏈抗體的次級(jí)抗體庫(kù)，篩選高親和力、可內(nèi)化的抗Met全人基因工程小分子抗體，為研制抗腫瘤藥物、腫瘤的診斷和臨床治療提供新的選擇。研究?jī)?nèi)容如下： 實(shí)驗(yàn)一抗Met單鏈抗體噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室篩選出的全人抗MetFab抗體重鏈和輕鏈基因的互補(bǔ)決定區(qū)

2、序列和Kobat抗體基因數(shù)據(jù)庫(kù)序列，設(shè)計(jì)并合成數(shù)對(duì)寡核苷酸引物，分別在CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L2和CDR-L3以及框架區(qū)引入有限突變和隨機(jī)突變。 2.以經(jīng)過(guò)錯(cuò)配PCR突變和親和力初步成熟并篩選出的抗MetFab抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因?yàn)槟０?，通過(guò)不同引物的配對(duì)組合，VL1/VL3、VL2/VL4在輕鏈可變區(qū)CDR-L2、CDR-L3引進(jìn)隨機(jī)突變，VH2/VH6、VH1/VH4(VH3/VH6)、VH1

3、/VH5在重鏈可變區(qū)的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3引入有限突變或隨機(jī)突變，合成高度多樣性的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，經(jīng)重疊延伸PCR，擴(kuò)增并拼接合成VH和VL基因庫(kù)。VH和VL基因再通過(guò)重疊延伸PCR，合成單鏈抗體scFv基因庫(kù)。 3.單鏈抗體scFv基因和pComb3XSS載體分別用SfiI酶切，50℃消化5小時(shí)，經(jīng)膠回收并定量后，16℃連接過(guò)夜。重組質(zhì)粒經(jīng)酒精沉淀濃縮，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue

4、。通過(guò)優(yōu)化可影響轉(zhuǎn)化效率的參數(shù)，如電擊條件的設(shè)置，電擊后樣品的處理及DNA樣品的準(zhǔn)備等，獲得了庫(kù)容為9.83×108全人抗MetscFv抗體庫(kù)。 4.隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化克隆，提取重組質(zhì)粒。DNA測(cè)序結(jié)果表明，在19個(gè)VH和12個(gè)VL克隆中，序列正確的克隆分別為15個(gè)和10個(gè)，其正確率分別為84.2﹪和83.3﹪。核酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，CDR-L2和CDR-L3的突變率分別為70﹪和100﹪；CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3

5、的突變率分別為26.7﹪、100﹪和80﹪。 實(shí)驗(yàn)二高親和力、內(nèi)化的抗Met單鏈抗體的篩選與生物學(xué)特性分析1.基于活細(xì)胞表面受體的抗MetscFv抗體的篩選以轉(zhuǎn)化并穩(wěn)定表達(dá)Met基因的細(xì)胞系S114為陽(yáng)性靶細(xì)胞進(jìn)行篩庫(kù)，以NIH3T3細(xì)胞作為陰性篩選細(xì)胞。將新鮮制備的、約1011噬菌體抗體首先與S114的前體細(xì)胞NIH3T3(Met-)相混合并孵育一定時(shí)間，去除抗體庫(kù)中能夠與NIH3T3相結(jié)合的非特異性抗體。孵育混合物的上清再與

6、S114細(xì)胞(Met+)共同孵育，用完全培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞十次。將細(xì)胞重懸于適量的培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃1孵育小時(shí)，讓結(jié)合于細(xì)胞表面的噬菌體抗體內(nèi)化。用甘氨酸緩沖液(pH2.8)洗滌細(xì)胞，去除未內(nèi)化但仍結(jié)合于細(xì)胞上的噬菌體抗體。凍融并超聲破碎細(xì)胞，胰酶消化被內(nèi)化的噬菌體，感染大腸桿菌XL1-blue，進(jìn)行下一輪的擴(kuò)增和篩選。 2.噬菌體抗體的固相篩選將經(jīng)過(guò)NIH3T3/S114細(xì)胞系五輪陰性/陽(yáng)性細(xì)胞篩選并富集的噬菌體，進(jìn)

7、一步用固相抗原篩選。加入經(jīng)細(xì)胞篩選的噬菌體抗體于Met抗原包被的免疫板中孵育，37℃1小時(shí)。用不同的洗滌試劑如PBST或NH4SCN經(jīng)過(guò)多次不同強(qiáng)度的洗滌，去除未結(jié)合或者親和力比較弱的噬菌體，胰酶消化結(jié)合在抗原上的噬菌體，感染大腸桿菌XL1-Blue，進(jìn)行下一步分析。 3.陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定經(jīng)過(guò)五次NIH3T3/S114細(xì)胞篩選和兩次固相篩選的噬菌體，感染大腸桿菌XL1-Blue，隨機(jī)挑取60個(gè)克隆，以phageELISA進(jìn)行

8、鑒定，其中46個(gè)為陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為76.7﹪。選取PhageELISA檢測(cè)結(jié)果較高的28陽(yáng)性克隆，過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測(cè)序。DNA序列分析結(jié)果表明，在23個(gè)正確序列中，有四種不同的序列，分別為S1，S2，S3和S4。在28個(gè)克隆中，S1為18個(gè)，S3為3個(gè)，S2和S4各一個(gè)。重復(fù)PhageELISA結(jié)果表明，S1的A450值和滴度最高且較穩(wěn)定，提示S1可能是親和力較高的克隆。 4.抗MetscFv抗體的大量表達(dá)及純化S1克隆轉(zhuǎn)

9、化大腸桿菌TOP10，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并初步純化，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，稀釋滴度1∶80000時(shí)，A450Corr值為0.411(Blank為0.145)。該結(jié)果提示S1的親和力較高。 為提高S1的表達(dá)量，將S1scFv基因片段更換酶切位點(diǎn)后，經(jīng)NcoI和XbaⅠ同時(shí)酶切scFv和pBAD/gⅢ-A，純化后用T4DNA連接酶連接，重組表達(dá)載體pBAD/gⅢ-S1轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10并誘導(dǎo)大量表達(dá)。比較不同濃度的誘導(dǎo)物L(fēng)-阿

10、拉伯糖和誘導(dǎo)表達(dá)的溫度與時(shí)間，未見(jiàn)L-阿拉伯糖的濃度對(duì)表達(dá)量有明顯影響；由于表達(dá)產(chǎn)物在多個(gè)溫度條件下都形成包涵體，因此選擇37℃過(guò)夜表達(dá)。培養(yǎng)物經(jīng)離心沉淀后，菌體超聲破碎，沉淀物用0.1﹪TritonX-100緩沖液洗滌兩次后，包含體經(jīng)6M鹽酸胍變性和梯度透析去除鹽酸胍的復(fù)性處理。在1M和0.5M鹽酸胍時(shí)，加入適量的氧化/還原型谷胱甘肽和L-精氨酸。IMAC親和純化，0.2M咪唑洗脫后，經(jīng)Centricon更換緩沖液后用于特異性和生物活

11、性檢測(cè)。 5.抗MetscFv抗體的特性分析通過(guò)ELISA、免疫沉淀、細(xì)胞雙染和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)鑒定S1特異性。結(jié)果表明，復(fù)性后的單鏈抗體的稀釋滴度較分泌性S1抗體有所降低(ELISA稀釋滴度降低約10倍)。FACS分析結(jié)果表明，該單鏈抗體能夠與大量表達(dá)Met基因的S114細(xì)胞特異性結(jié)合，與陰性對(duì)照細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞沒(méi)有明顯的結(jié)合；免疫沉淀結(jié)果顯示，單鏈抗體能夠結(jié)合S114和MKN45細(xì)胞表面的Met蛋白。用免疫熒光分析噬菌體

12、抗體的內(nèi)化能力，顯示在噬菌體抗體結(jié)合細(xì)胞0.5小時(shí)后，在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)信號(hào)，2小時(shí)后，信號(hào)明顯增強(qiáng)。熒光雙染結(jié)果表明，單鏈抗體與陽(yáng)性細(xì)胞MKN45的結(jié)合信號(hào)，與抗Met的多克隆抗體信號(hào)重疊，而陰性對(duì)照細(xì)胞NIH3T3基本沒(méi)有信號(hào)，提示單鏈抗體是特異性結(jié)合于細(xì)胞表面的HGF受體Met蛋白。以上結(jié)果提示S1能夠與具有特定空間構(gòu)像的Met分子胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并能夠被內(nèi)化。S1親和力檢測(cè)Kd為5.15X10-8M，較突變前Fab的親和力提高117倍。

13、 實(shí)驗(yàn)三內(nèi)化的抗MetFab抗體分子的構(gòu)建、表達(dá)與功能分析1.Fab抗體分子表達(dá)載體的構(gòu)建以S1的VH和VL為模板，擴(kuò)增Fab的重鏈與輕鏈可變區(qū)基因，pComb3XTT重組載體為模板，擴(kuò)增重鏈、輕鏈恒定區(qū)基因。經(jīng)3輪PCR合成編碼Fab基因片斷。Fab基因和pComb3XSS載體分別經(jīng)SfiI酶切和連接后，重組表達(dá)質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌TOP10表達(dá)。 2.Fab抗體片段的表達(dá)與純化取單克隆菌落過(guò)夜培養(yǎng)并經(jīng)IP

14、TG誘導(dǎo)表達(dá)。比較不同的培養(yǎng)條件，如SB培養(yǎng)液和LB培養(yǎng)液、不同的誘導(dǎo)表達(dá)溫度，結(jié)果顯示，溫度對(duì)Fab分泌性表達(dá)影響較大，在37℃條件下，培養(yǎng)上清未見(jiàn)Fab蛋白，在25℃和20℃時(shí)，上清中出現(xiàn)Fab，表達(dá)量較低。在誘導(dǎo)表達(dá)前的培養(yǎng)液中加入2﹪葡萄糖抑制基礎(chǔ)表達(dá)，以新培養(yǎng)液重懸細(xì)菌，加入IPTG在25℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，明顯提高Fab的分泌性表達(dá)量。表達(dá)上清與細(xì)菌沉淀高滲提取上清混合，經(jīng)FPLC純化，結(jié)合在ProteinL上Fab經(jīng)洗脫和透

15、析處理后，用于活性分析。 3.Fab分子的生物學(xué)活性分析Fab經(jīng)ELISA、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)和親和力檢測(cè)分析表明，稀釋滴度從40增加到2560倍時(shí)，A450Corr值從0.782降低到0.112(Blank0.078)；FACS分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ab能夠與Met陽(yáng)性細(xì)胞S114特異性結(jié)合，而與Met陰性細(xì)胞NIH3T3未見(jiàn)有結(jié)合；免疫沉淀結(jié)果表明，F(xiàn)ab能夠結(jié)合S114和MKN45細(xì)胞中的Met前體蛋白和Met功能蛋白。以上研

16、究結(jié)果提示，F(xiàn)ab分子具有與Met結(jié)合的能力和特異性，與單鏈抗體S1相比，其親和力有所降低，F(xiàn)ab的Ka值2.46X106L/mol，Kd值為4.063X10-7M。競(jìng)爭(zhēng)ELISA顯示，F(xiàn)ab0(突變前)和Fab(來(lái)源于scFv)都能夠抑制scFv與Met的結(jié)合，提示scFv和Fab與改造前的Fab0具有相同的結(jié)合位點(diǎn)。4.Fab抗體分子的內(nèi)化和體外抑制試驗(yàn) 為了驗(yàn)證Fab分子能夠特異性結(jié)合細(xì)胞表面的Met受體并能夠被內(nèi)化，用標(biāo)

17、記肥皂草毒素的抗人IgG的Hum-ZAP間接標(biāo)記Fab分子。肥皂草毒素(saporin)能夠與細(xì)胞核糖體亞基結(jié)合，抑制細(xì)胞蛋白的合成，引發(fā)細(xì)胞的凋亡。Hum-ZAP為連接有肥皂草毒素的抗人IgG，能夠與人源抗體分子IgG或Fab特異性結(jié)合，被具有內(nèi)化特性的抗體分子帶入細(xì)胞內(nèi)，肥皂草毒素抑制細(xì)胞的蛋白合成。Hum-ZAP與抗MetFab按比例混合后，加入培養(yǎng)有NIH3T3和S114細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中。MTS/PMS檢測(cè)結(jié)果顯示，100n