人類免疫缺陷病毒診斷抗體的親和力成熟.pdf

1、9E8是本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的一株針對(duì)人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)的鼠源抗體,其親和力為3.23×10-10M,目前已經(jīng)成功應(yīng)用到本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的HIV診斷試劑盒中,但其靈敏度和特異性都還有待提高。
　　 本研究的目的就是利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)HIV診斷抗體9E8進(jìn)行親和力成熟,進(jìn)一步提高HIV診斷的靈敏度和特異性。首先,用RT-PCR的方法從雜交瘤細(xì)胞中調(diào)取鼠源抗體9E8的可變區(qū)基

2、因,將其構(gòu)建成單鏈抗體VH-(G4S)3-VL的形式,展示到噬菌體pⅢ蛋白上,并驗(yàn)證ScFv的活性。確定噬菌體ScFv具有結(jié)合活性后,用CDR替換的方法,確定抗體抗原結(jié)合的關(guān)鍵CDR區(qū)。將9E8-ScFv的VH和VL氨基酸序列分別輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中,按照骨架區(qū)同源度最高而CDR氨基酸序列差異最大的原則,搜尋人源抗體的CDR序列作為CDR替換序列,每個(gè)9E8-ScFv中的CDR對(duì)應(yīng)2種替換序列。CDR替換后,用Elisa方法檢測(cè)活性,

3、最終確定了三個(gè)關(guān)鍵CDR區(qū),即:HCDR2、HCDR3和LCDR3。
　　 確定了抗體抗原結(jié)合的關(guān)鍵CDR區(qū)之后,接下來就是對(duì)關(guān)鍵CDR區(qū)實(shí)施單點(diǎn)突變,以此獲得每個(gè)關(guān)鍵CDR區(qū)的突變熱點(diǎn)及其氨基酸變化規(guī)律。根據(jù)突變熱點(diǎn)及其氨基酸變化規(guī)律,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,構(gòu)建了3個(gè)親和力成熟初級(jí)噬菌體文庫HCDR2、HCDR3和LCDR3,庫容大小分別為2.0×109、1.66×109和1.68×108。以p24作為抗原,用固相篩選的方法對(duì)初級(jí)噬菌

4、體文庫進(jìn)行篩選,每個(gè)初級(jí)庫篩選三輪,并分別挑取一定數(shù)目的單克隆菌落進(jìn)行檢測(cè)。再以初級(jí)噬菌體文庫篩選三輪后的多樣性克隆序列為模板,進(jìn)一步構(gòu)建親和力成熟次級(jí)噬菌體文庫9E8HK(庫容:8×100),用更加苛刻的篩選條件對(duì)其進(jìn)行篩選。然后,挑取800個(gè)單克隆菌落進(jìn)行檢測(cè),并用ScFv競(jìng)爭(zhēng)的方法對(duì)高親和力噬菌體單鏈抗體進(jìn)行初步篩選,最終8個(gè)結(jié)合活性最好的克隆進(jìn)行真核表達(dá),得到了一株親和力提高5.7倍的抗體9E8HK-491,其親和力達(dá)到5.64