人源抗HBsAgFab的優(yōu)化表達(dá)及親和力測(cè)定.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文人源抗HBsAgFab的優(yōu)化表達(dá)及親和力測(cè)定姓名：鄭大勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：羅榮城2001.6.1第二部分人源抗HBsAgFab的優(yōu)化表達(dá)及其親和一一一一————j力測(cè)定卜一一摘要目的：對(duì)人源抗HBsAgFab在XLl一BLUE工程菌中的搖瓶發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用圃相法測(cè)定Fab的功能性親和常數(shù)，為利用發(fā)酵罐大批量發(fā)酵生產(chǎn)Fab及臨床應(yīng)用抗HBsAgFab作為腫瘤導(dǎo)向治療載體提供理論基礎(chǔ)

2、。方法：篩選轉(zhuǎn)化有抗HBsAgFab質(zhì)粒的XLlBLUE工程菌陽性克隆，測(cè)定以不同菌體濃度作為誘導(dǎo)表達(dá)起點(diǎn)時(shí)Fab的得率，經(jīng)優(yōu)化表達(dá)后大量提取antiHBsFab。以親和層析法純化后進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳及Westernblot鑒定并用于抗體親和常數(shù)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用固相法中非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定了Fab的親和常數(shù)。經(jīng)優(yōu)化乙肝表面抗原包板濃度、包板時(shí)間、Fab與表面抗原的孵育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件后，測(cè)定了4個(gè)抗原濃度梯度包板條件下HBsA

3、g與系列濃度抗體Fab結(jié)合的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。隨后通過作圖法確定出最大吸光度值50％時(shí)(OD50％)的抗體濃度，將測(cè)得的結(jié)果代入變形后的質(zhì)量作用定律(LawofMassAction)方程中，計(jì)算出抗HBsAgFab及對(duì)照組抗HBsAgIgG的功能性親和常數(shù)。結(jié)果：以O(shè)D600_14時(shí)的菌體濃度為誘導(dǎo)表達(dá)的起點(diǎn)，此時(shí)Fab的得率較以O(shè)D600=08時(shí)有明顯提高，且經(jīng)Westernblot證實(shí)Fab的抗原結(jié)合活性良好。經(jīng)非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得