高親和力人源化抗CD20抗體的構(gòu)建及生物學(xué)功能研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤是一種常見的B細(xì)胞型淋巴瘤?，F(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)中的放化療技術(shù)已經(jīng)不能滿足人類迫切治療該類疾病的渴求，而具有靶向治療機(jī)制的單克隆抗體方法開始被人們廣泛研究和應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)CD20分子表達(dá)于NHL細(xì)胞表面，則此分子是靶向治療的理想靶點(diǎn)。利妥昔單抗（Rituxiamb)是第一個(gè)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市并用于治療NHL的單抗藥物。但因Rituximab分子中含有30％的鼠源序列，患者在長(zhǎng)期用藥以后，易引起人抗鼠抗體免疫

2、應(yīng)答（HAMA)而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。同時(shí)，Rituximab的臨床反應(yīng)率只有50%，完全緩解率僅有10%。因此，嚴(yán)重制約了Rituximab在臨床中的長(zhǎng)期應(yīng)用。針對(duì)這一現(xiàn)象，人們開始對(duì)Rituximab進(jìn)行改造，有的用與鼠源序列相似的人骨架區(qū)來替換Rituximab中的鼠源框架區(qū)，有的用提高Rituximab的親和力來加強(qiáng)抗腫瘤活性。如將兩者同時(shí)進(jìn)行改造，則殺傷腫瘤細(xì)胞的效果有可能比只是改造其中一方面的效果要好。
　　目的：改造

3、新型的抗體可以從親和力和免疫原性兩方面進(jìn)行，可通過提高親和力來增加抗原與抗體的識(shí)別和結(jié)合，對(duì)于免疫原性主要是通過降低抗體中的鼠源序列來減少在人體內(nèi)的抗性。本文旨在構(gòu)建較高親和力和較低免疫原性的CD20抗體，并驗(yàn)證是否具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。
　　方法：⑴通過專利分析，進(jìn)行高親和力和人源化的設(shè)計(jì)改造，將CD20H和CD20L分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1/ZEO(+)中去，利用轉(zhuǎn)染試劑jetPEI將輕重

4、鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1，通過有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞株的篩選，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)mRNA，ELISA檢測(cè)表達(dá)量，并將貼壁細(xì)胞馴化成懸浮培養(yǎng)。⑵利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清與CD20陽(yáng)性細(xì)胞Raji的結(jié)合活性，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)，如細(xì)胞殺傷活性、ADCC效應(yīng)以及CDC效應(yīng)。
　　結(jié)論：獲得了目的抗體輕鏈和重鏈的基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1/ZEO(+)-CD20L和pcDNA3.1(+)-CD2