抗人CD86單鏈抗體的研制及生物學功能研究.pdf

1、CD86（又稱B7-2）是表達在抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）表面的重要共刺激分子，其受體是表達在T細胞表面的CD28分子。CD86與CD28結合轉導的信號，對T細胞的活化、增殖與功能發(fā)揮起著重要作用。CD86的編碼基因為1120bp，由306個氨基酸組成，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白。單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）是一種新型重組抗體，是將抗體重鏈可變區(qū)（

2、VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）用一條彈性短肽連接而成的小分子抗體片段，此類抗體的優(yōu)點是分子量小、免疫原性弱、滲透性強、并具有藥物導向及中和毒素等功能。本研究在成功制備了鼠抗人CD86單克隆抗體及其相應人-鼠嵌合抗體的基礎上，構建了抗人CD86-scFv的真核表達載體并在CHO細胞中得到穩(wěn)定表達，進而對該抗體的生物學功能進行了初步研究。
　　第一部分抗人CD86單鏈抗體（CD86-scFv）的構建及表達
　　目的：構建抗人CD86

3、-scFv基因并在CHO細胞中表達，篩選穩(wěn)定表達該抗體的細胞株。
　　方法：采用RT-PCR從分泌鼠抗人CD86單克隆抗體的雜交瘤細胞株（克隆號：1D1）中克隆VH及VL基因。重疊延伸拼接PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）方法構建具有前導肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因，并克隆至真核表達載體pIRES2-EGFP。脂質體轉染法轉染至中華倉鼠卵巢細胞（C

4、HO），G418加壓篩選，采用流式細胞術鑒定出穩(wěn)定表達抗人CD86-scFv的細胞株。
　　結果：構建的抗人CD86-scFv基因全長為780bp，測序后經(jīng)BLAST比對，證明該序列為鼠源親本抗體的可變區(qū)基因，并含有信號肽、連接肽以及His標簽。轉染CHO細胞，G418加壓篩選后獲得了穩(wěn)定表達抗人CD86-scFv的細胞株，命名為SA-IV。培養(yǎng)上清與L929-CD86細胞的陽性結合率為64.8%。
　　結論：成功構建了穩(wěn)定

5、表達抗人CD86-scFv的細胞株SA-IV，為進一步研究該抗體的生物學活性提供了物質基礎。
　　第二部分抗人CD86-scFv的生物學功能研究
　　目的：制備抗人CD86-scFv，分析其與不同人源細胞株膜型CD86分子的結合特性及介導的生物學功能。
　　方法：大批量培養(yǎng)細胞株SA-IV，收集上清，Profinity TM IMAC鎳預裝柱分離純化CD86-scFv。采用流式細胞術分析CD86-scFv對基因轉染細胞

6、株L929-CD86以及天然表達CD86分子的人B系淋巴瘤細胞Raji和Daudi膜型CD86分子的識別。競爭抑制實驗分析該抗體與鼠源親本抗體1D1競爭結合相應抗原的能力。在Raji細胞的培養(yǎng)體系中加入不同濃度的CD86-scFv，MTT法分析CD86-scFv對Raji細胞增殖的影響，流式細胞術分析該抗體誘導Raji細胞凋亡的作用。CD86-scFv與Raji細胞共孵育后接種BABL/c裸鼠，觀察抗體對腫瘤細胞成瘤性的影響。
　

7、　結果：經(jīng)大量培養(yǎng)SA-IV并收集培養(yǎng)上清，鎳預裝柱分離純化CD86-scFv的得率為4.2mg/L。CD86-scFv能特異性識別L929-CD86、Raji以及Daudi細胞表面的CD86分子，陽性結合率分別為67.0%、72.3%及80.5%。該抗體對鼠源親本抗體1D1具有競爭結合能力。在Raji細胞培養(yǎng)體系中加入CD86-scFv，細胞生長抑制率為28.3%，凋亡率為11.2%。Raji細胞與CD86-scFv共孵育后接種BAL