抗人CD28單鏈抗體和嵌合抗體轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及單鏈抗體基因在BmN細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、CD28分子是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，參與介導(dǎo)T細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激信號(hào)，屬于免疫球蛋白超家族。已有的研究表明，CD28單克隆抗體對(duì)腫瘤、自身免疫性疾病及移植排異等均具有重要的治療意義，但體內(nèi)長(zhǎng)期使用會(huì)降低治療效果。為了降低人抗鼠免疫反應(yīng)，必須在臨床應(yīng)用前對(duì)CD28單克隆抗體進(jìn)行改造。本研究在對(duì)抗人CD28單克隆抗體進(jìn)行改造的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，并在BmN細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。主要成果如下： l、將抗人CD

2、28鼠源性單抗的可變區(qū)基因和人IgGl的恒定區(qū)基因，采用一種不需要限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的新方法——三引物PCR(TP-PCR)法拼接成嵌合抗體基因，分別插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW3的ph和p10啟動(dòng)子后，成功構(gòu)建了抗人CD28的重組轉(zhuǎn)移載體pAcUW3／CD28-vH-γ1，vL-κ。 2、采用TP-PCR法，將抗人CD28單抗的重、輕鏈可變區(qū)基因和人工設(shè)計(jì)的昆蟲桿狀病毒多角體蛋白基因偏好的連接肽序列，拼接成抗人CD28

3、單鏈抗體基因，并將其插入昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8的ph基因啟動(dòng)子后，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8／CD28-ScFv?；蚱唇訒r(shí)，在抗體鏈段的C端增加了6xHistag序列，便于表達(dá)產(chǎn)物的純化。 3、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8／CD28-ScFv和線性化的Bm-BacPAK6共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，利用空斑分析以及藍(lán)白斑篩選相結(jié)合的方法，篩選出重組桿狀病毒Bm-BacPAK6CD28-ScFv

4、，并用PCR方法對(duì)此重組病毒進(jìn)行了鑒定。 4、將重組病毒Bm-BacPAK6CD28-ScFv接種BmN細(xì)胞，定期收取感染細(xì)胞，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和WesternBlotting分析。結(jié)果表明，在分子量約為28kD處有一清晰的亮帶，說(shuō)明抗人CD28單鏈抗體基因在BmN細(xì)胞中得到了特異性表達(dá)。表達(dá)始于24h，表達(dá)峰在72h。 抗人CD28單鏈抗體和嵌合抗體基因轉(zhuǎn)移載體的成功構(gòu)建及抗人CD28單鏈抗體基因在Bm