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1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文抗人AFP單鏈抗體的制備和鑒定姓名:張平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):醫(yī)學(xué)免疫學(xué)指導(dǎo)教師:蔡美英20030430墮型苧堂墮主絲奎.比較顯示:人A F P 與H S A 有5 0 %氨基酸同源。凍存復(fù)舒的3 株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體有2 株與人血清白蛋白存在嚴(yán)重交叉反應(yīng),最后篩選出1 株與人血清白蛋白無(wú)交叉反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株用于以后的研究;提取的R N A 有2 8 S ,1 8 S ,5 S 三條帶明顯,無(wú)降解;經(jīng)R
2、T - P C R擴(kuò)增的V H 和v L 基因大小位于2 5 0 b p 和5 0 0 b p 之聞,V H 略大于V L :經(jīng)重疊延伸P C R 擴(kuò)增,將V H 和V L 連接后構(gòu)建的S c F v 基因大約7 5 0 b p ;酶切及P C R 鑒定顯示:S c F v J 下確克隆至p G E M .T 載體,成功構(gòu)建了p G E M .A 質(zhì)粒;測(cè)序結(jié)果顯示:S c F v 基因由6 9 9 個(gè)堿基組成,其中含3 3 9 b p
3、 的V H 和3 1 5 b p 的V L 及4 5 b p 的連接肽堿基,閱讀框架正確;p E T .A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L .2 1 ( D E 3 ) ,誘導(dǎo)篩選出5 株有相應(yīng)分子量大小的陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切、P C R 、測(cè)序鑒定顯示成功構(gòu)建了p E T .A 質(zhì)粒,根據(jù)測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)S c F v 由2 3 3 個(gè)氨基酸組成,V H 有1 1 3 個(gè),V L 有1 0 5 個(gè),兩者由( 0 4 S ) 3 連接肽連接,
4、與預(yù)期結(jié)果一致。細(xì)菌溶解后反復(fù)洗滌可獲得較高純度的蛋白:包涵體變性后采用透析復(fù)性的方法可使復(fù)性率達(dá)7 4 %。S D S .P A G E 電泳顯示:T r x A .S c F v 融合蛋白分子量約4 1 K d ,酶切后純化的S c F v 分子量約2 7 K d ,T r x A 分子量約1 4 K d ??贵w活性經(jīng)E L I S A 抑制實(shí)驗(yàn)顯示,復(fù)性后抗體活性為單克隆抗體的2 5 %,經(jīng)純化后S c F v 抗體活性增加到單克
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