抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體的制備.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)是單鏈DNA病毒，可引發(fā)傳染病，使犬表現(xiàn)為出血性腸炎和非化膿性心肌炎等癥狀。對(duì)于疾病的治療，業(yè)內(nèi)采用特異性治療，同時(shí)對(duì)癥治療、支持治療予以輔助。對(duì)癥治療、支持治療主要能減輕嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀，但不能消除病毒。特異性療法常采用高免血清、犬細(xì)小病毒單克隆抗體，但高免血清的效價(jià)不穩(wěn)定，單克隆抗體的制備過(guò)程復(fù)雜，易引起異源蛋白反應(yīng)，不能有效的治療該病。因此本試驗(yàn)在制備了單克隆抗體的基礎(chǔ)

2、上，又進(jìn)一步制備了單鏈抗體。
　　單克隆抗體的制備方法:用PEG濃縮病毒后，經(jīng)蔗糖梯度密度離心純化，免疫老鼠，3次腹腔注射后，測(cè)定效價(jià)，再加強(qiáng)免疫，3d后進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)篩選和亞克隆后，獲得了5株雜交瘤細(xì)胞，都可以穩(wěn)定的分泌單克隆抗體。分別命名為1G4、1E12、2C3、2H9、3F9，檢測(cè)各細(xì)胞株的特性。亞類鑒定結(jié)果表明1E12、1G4、3F9屬于IgG1，2C3、2H9屬于IgG2a。中和活性鑒定結(jié)果表明3F9具有中和犬細(xì)小病

3、毒的活性。因此制備3F9雜交瘤細(xì)胞的單鏈抗體。
　　提取3F9的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA鏈，并以此為模板擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，利用SOE PCR方法連接VH基因和VL基因，同時(shí)引入(Gly4Ser)3連接肽序列，擴(kuò)增得到大小為765 bp的單鏈抗體(ScFv)基因。將ScFv基因連接至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-32a-ScFv，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并在

4、37℃條件下進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析大小約為46kD，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)Western-blotting鑒定該蛋白能被抗His標(biāo)簽的單克隆抗體特異性識(shí)別。間接ELISA試驗(yàn)以及中和試驗(yàn)結(jié)果表明，ScFv能夠與犬細(xì)小病毒結(jié)合，具有中和犬細(xì)小病毒的活性。
　　試驗(yàn)獲得了5株能穩(wěn)定分泌抗CPV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，成功擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞株3F9的ScFv基因，并實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá)，為探索CPV的防控打下了基礎(chǔ)