犬細(xì)小病毒基因疫苗的研究.pdf

1、為了研究犬細(xì)小病毒基因疫苗,該研究根據(jù)己發(fā)表的犬細(xì)小病毒(CPV)VP2基因序列設(shè)計(jì)引物,用高保真PCR從CPV-YZ株中擴(kuò)增出兩個(gè)長約1.7kb的VP2基因片斷(3′端有和無CpG基序),將擴(kuò)增片段克隆入pGEM-T載體,序列測定結(jié)果顯示所獲核苷酸序列與已發(fā)表的CPV VP2序列的同源性為99％.分別將兩種基因片段克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3和pCEP4,構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-VP2、pcDNAC1-VP2、pCEP4-V

2、P2和pCEPC1-VP2,用四種重組質(zhì)粒注射BALB/c小鼠,經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)證明注射小鼠的血清中含有CPV特異抗體,血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示,注射的四種重組質(zhì)粒均能產(chǎn)生較高的抗CPV抗體,其中pcDNAC1-VP2產(chǎn)生的抗體水平最高.用上述四種重組質(zhì)粒免疫畢格犬,血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,四種重組質(zhì)粒均產(chǎn)生抗CPV特異抗體,對基因注射犬進(jìn)行的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,pcDNA3-VP2和pcDNAC1-VP2免疫組的存活率分別為25％(1/

3、4)和50％(2/4),而pCEP4-VP2和pCEPC1-VP2免疫組無犬存活.在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)限制酶切圖譜分析結(jié)果,用限制酶消化法切除了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3中的neo基因.根據(jù)Kan<'r>基因序列設(shè)計(jì)引物,用高保真PCR從pET-30a質(zhì)粒中擴(kuò)增出Kan<'r>基因及調(diào)控區(qū),并用其取代pcDNA3中的Amp<'r>基因,獲得的改造質(zhì)粒命名為pcDNAK.再根據(jù)CPV VP2基因序列設(shè)計(jì)引物,并在下游引物的3′-端引入6

4、拷貝的犬源CpG序列,用高保真PCR從CPV-YZ株中擴(kuò)增出約1.7Kb的VP2基因,將其克隆入pGEM-T載體,序列測定結(jié)果顯示獲得的VP2基因及CpG序列正確.將其克隆入pcDNAK質(zhì)粒,將獲得的基因免疫載體命名為pcDNAKC2-VP2.分別用pcDNAC1-VP2和pcDNAKC2-VP2免疫畢格犬,經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)證明,pcDNAKC2-VP2免疫犬的血凝抑制效價(jià)高于pcDNAC1-VP2,提示可用于犬細(xì)小病毒基因疫苗的進(jìn)一步研