犬細(xì)小病毒DD分離株的鑒定及基因組序列分析.pdf

1、目的:對本實(shí)驗(yàn)室從疑似犬細(xì)小病毒感染的發(fā)病犬糞便中分離的病毒進(jìn)行全面鑒定和分型;完成分離毒株的全基因組測序,分析進(jìn)化變異情況;研究細(xì)胞傳代過程中分離毒株生物學(xué)特性變化和VP2基因的變異關(guān)系,為疫苗的研究提供依據(jù)。
　　 方法:采用同步培養(yǎng)法接種貓腎細(xì)胞(CRFK)增殖病毒,通過PCR試驗(yàn)、HA試驗(yàn)、HI試驗(yàn)、IFA試驗(yàn)、電鏡觀察、動(dòng)物同歸試驗(yàn)和VP2基因測序分析進(jìn)行病毒的鑒定和分型;通過對分離毒株全基因組測序,并利用DNAsta

2、r軟件和Web server Uses Mfold(Version3.2)軟件分析本毒株和細(xì)胞多次傳代獲得的CPV-N株基因組的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu),研究分離毒株的變異情況。將病毒在CRFK細(xì)胞上連續(xù)傳代,對發(fā)生典型特征變化的代次進(jìn)行VP2基因擴(kuò)增和測序分析,推測VP2氨基酸殘基的非同義置換和病毒相關(guān)生物學(xué)特性改變的關(guān)系。
　　 結(jié)果:經(jīng)鑒定本實(shí)驗(yàn)室分離的病毒為犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株,命名為CPV-DD株。對分離毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可擴(kuò)

3、增出特異性DNA片段(1163bp);盲傳至第3代時(shí),HA效價(jià)為1:8,其血凝性能被特異性抗體抑制;IFA可見特異性亮綠色熒光,TCID50為103.0/0.1mL;電鏡觀察可見20nm左右的病毒顆粒,動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明CPV-DD株F3對犬的致死率為100％,在CRFK細(xì)胞傳至第18代時(shí),失去對犬的致病力。病毒VP2蛋白序列分析顯示該毒株為CPV-2a型,其氨基酸序列在324位出現(xiàn)Try→Ile替換,處于VP2蛋白的潛在抗原表位。

4、>　　 病毒的全基因組測序結(jié)果顯示CPV-DD株F33’-UTR僅有一個(gè)重復(fù)序列,而F18和CPV-N株均有3個(gè)重復(fù)序列。CPV-DD株F18和CPV-N株的3’-UTR和VP1基因5’端的二級結(jié)構(gòu)較為相似,而CPV-DD株F3和前兩者有較大差異。推測CPV-DD株在細(xì)胞傳代過程中發(fā)生的這種改變可能與病毒適應(yīng)細(xì)胞有關(guān)。
　　 CPV-DD株在CRFK細(xì)胞上共傳至第33代,對發(fā)生典型生物學(xué)特征變化代次的VP2基因進(jìn)行測序分析,其