犬細(xì)小病毒南京分離株（CPV-GN）VP2基因的克隆、序列分析及其部分片段的表達(dá).pdf

1、　　犬細(xì)小病毒(CPV)于1978年首次分離自美國(guó)，屬于細(xì)小病毒屬貓細(xì)小病毒亞群。CPV病毒粒子主要由VP1、VP2和VP3三種衣殼蛋白混合組成。其中VP2占絕大部分比例。多方研究已證實(shí)，VP2對(duì)感染犬只具免疫保護(hù)性?！　”狙芯渴紫仁褂脗鹘y(tǒng)的病毒學(xué)方法，如血凝實(shí)驗(yàn)、病毒分離、理化性質(zhì)分析，對(duì)3份分離自南京地區(qū)的CPV疑似糞樣進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明3份樣品均表現(xiàn)出典型的CPV理化性狀及毒力特征。隨后使用PCR技術(shù)及專(zhuān)門(mén)的CPV亞型區(qū)分引物

2、，對(duì)上述樣品進(jìn)行了型別鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3份樣品均為CPV-2b亞型感染所致。　　本研究涉及CPV-GN毒株VP2基因的克隆與序列分析。以常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增CPV南京分離株CPV-GN衣殼蛋白VP2基因，并將之插入到pMD18-T中，構(gòu)建克隆載體pMD-VP2以進(jìn)行T-A克隆。重組質(zhì)粒測(cè)序后與CPV-d、CPV-15、CPV-39、CPV-133參考株及世界各地若干分離株進(jìn)行序列分析、比較發(fā)現(xiàn)CPV-GN株VP2基因發(fā)生了一定程度的突

3、變，如其在第18、354、405、1465和1543堿基處分別發(fā)生了T→A、A→G、G→A、G→A和T→A突變。其中第1465位的G→A點(diǎn)突變使纈氨酸489變?yōu)楫惲涟彼幔?543位的T→A點(diǎn)突變使絲氨酸515變?yōu)樘K氨酸。　　本文為CPV基因工程疫苗的研制作了基礎(chǔ)理論分析與實(shí)驗(yàn)性研究。以CPV-GNDNA為母本，參照pMD-VP2重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果及CPV-d、CPV-15、CPV-39等參考株序列，使用Protean軟件對(duì)CPV-GN

4、株VP2基因進(jìn)行免疫原性分析后鎖定其第706～1239核苷酸之間所編碼的具良好的免疫原性潛能的部分片段(VP2’片段)，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物兩端分別添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增該片段，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以T-A法克隆入pMD18-T載體，構(gòu)建了pMD-VP2’重組質(zhì)粒。雙酶切回收目的條帶后，亞克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-VP2’。轉(zhuǎn)化宿主菌BL2