犬細小病毒VP2蛋白穩(wěn)定表達細胞系的建立.pdf

1、犬細小病毒病是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種急性傳染病。此病以主要表現(xiàn)急性出血性胃腸炎和急性心肌炎。此病傳染性強，發(fā)病率和死亡率高，是一種危害犬，特別是幼犬的一種重要傳染性疾病。
　　 人們研究證明宿主細胞膜上的轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)是犬、貓等動物細小病毒侵入宿主細胞的受體。在感染過程中，病毒的衣殼蛋白VP2可以與宿主細胞膜TfR結合，在該受體介導下

2、通過依賴dynamin和clathrin介導的內吞過程使病毒侵入宿主細胞。
　　 為了在分子水平上研究VP2與TfR的相互作用，需要制備VP2蛋白。為獲得大量具有生物活性的VP2蛋白，我們選用真核表達系統(tǒng)。采用人的CD5信號肽構建了VP2分泌型表達載體，并利用CHO-K1細胞建立了VP2蛋白穩(wěn)定表達細胞系。
　　 首先通過酶切從含有人CD5信號肽序列的質粒中將CD5信號肽片段切出，分離純化酶切片段，并將其克隆到pcDNA

3、3.1A的多克隆位點上，再轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經過酶切鑒定篩選出陽性克隆，測序正確的重組質粒命名為pcDNA3.1-CD5sp。
　　 然后根據 GenBank中CPV的VP2序列（AB120727）設計1對引物，通過PCR方法從含有VP2基因的質粒中擴增VP2基因的編碼序列，并將其插入到pcDNA3.1-CD5sp載體中CD5信號肽的下游，使其與CD5信號肽序列融合，構建成VP2基因的真核分泌型表達載體pcDNA-

4、CD5sp-VP2。
　　 為了解構建的真核表達載體能否在真核細胞進行分泌性表達，首先經磷酸鈣介導轉染293T細胞，使其在真核細胞中進行分泌表達。通過測序，結果表明，構建的犬細小病毒VP2基因的分泌型表達載體結構正確，在293T細胞中的表達產物經Western-blot檢測證明人的CD5信號肽序列能夠介導犬細小病毒VP2基因在真核細胞進行分泌性表達。
　　 然后經脂質體介導，將重組pcDNA-CD5sp-VP2質粒載體和