豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1主要抗原區(qū)的原核表達(dá)以及間接VP2-ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起的以母豬特別是初產(chǎn)母豬不孕、流產(chǎn)，產(chǎn)出死胎、畸胎、木乃伊胎以及弱仔為特征的繁殖障礙性疾病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了加強(qiáng)對該病的疫情監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查，有必要研究開發(fā)出一種特異性強(qiáng)和敏感性高的血清學(xué)檢測試劑。PPV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2(Structural Protein2)具有良好的免疫原性，可作為理想的血清學(xué)檢測用抗原[1]。

2、另外，PPV持續(xù)感染的豬體內(nèi)會產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白NSI(Nonstructural Protein1)的抗體，據(jù)此，NS1可作為診斷用抗原來區(qū)別滅活苗免疫和自然感染。 本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PPV VP2和NS1蛋白的主要抗原表位區(qū)，獲得了純化的重組蛋白，用純化的VP2重組蛋白初步建立了間接VP2-ELISA，并對NS1重組蛋白的適用性進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容如下： 一、豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1主

3、要抗原區(qū)的原核表達(dá) 參照GenBank發(fā)表的PPV中國株基因序列，分別設(shè)計出針對VP2和NS1的引物，通過PCR方法擴(kuò)增出包含VP2和NS1主要抗原表位區(qū)509bp和698bp的基因片斷，克隆到pGEM-T-Vector上，再分別插入到原核表達(dá)載體pET-32(a)的T7啟動子下游，建立pET-VP2和pET-NS1兩個重組表達(dá)載體，將載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量大小分別為39.1KDa和45

4、KDa。經(jīng)BandScan軟件分析，表達(dá)量分別占菌體蛋白的65.2％和53.1％。Western-blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白均能與PPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His·Bind親和層析法純化后，獲得的重組蛋白VP2和NS1的濃度達(dá)到1.53mg/ml和0.35mg/ml。 二、豬細(xì)小病毒血清抗體間接VP2-ELISA檢測方法的初步建立 將純化后的重組蛋白VP2作為抗原包被聚乙烯微量反應(yīng)板，以辣根過氧化

5、物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，初步建立了針對VP2抗體的間接VP2-ELISA。對ELISA各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最適工作條件。研究結(jié)果表明，重組抗原最適包被濃度為306ng/孔，4℃包被過夜，待檢血清最適稀釋度為1:50。待檢血清和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時間分別為37℃，30min和37℃，15min；底物37℃顯色10min，讀OD450值。血清樣品OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判為陽性。用建立的間接VP2-EL