豬腦心肌炎病毒GXLC株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis viurs，EMCV)是RNA病毒科心病毒屬的成員，可以引起仔豬腦炎、心肌炎以及母豬繁殖障礙為特征的傳染病。本研究針對(duì)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增出831bp的完整VP1基因片段。將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建了EMCVVP1基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-VP1。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3

2、)株感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示VP1蛋白獲得成功表達(dá)，融合蛋白的分子質(zhì)量約為52ku，表達(dá)的重組蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)Western-blot試驗(yàn)，表明重組VP1蛋白與豬抗EMCV陽性血清發(fā)生特異性的免疫印跡反應(yīng)。
　　 利用純化的重組蛋白VP1作為包被抗原，建立了用于檢測(cè)EMCV抗體的間接ELISA方法。經(jīng)優(yōu)化，獲得間接ELISA的最佳條件：以pH9.6、濃度為0.05mol/L的碳

3、酸鹽緩沖液做包被液；抗原包被濃度為0.625ug/mL，室溫作用2h后4℃包被過夜；待檢血清稀釋度為1:40，作用時(shí)間為60min；酶標(biāo)二抗兔抗豬IgG-HRP工作濃度為1:6000，待檢血清與酶標(biāo)二抗作用條件為37℃30min；底物在室溫避光條件顯色時(shí)間為15min；血清樣本陰陽性臨界值為0.33。特異性試驗(yàn)表明重組VP1抗原與豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬口蹄疫的陽性血清無交叉反應(yīng)。
　　 應(yīng)用所建立的間接EL

4、ISA方法對(duì)廣西地區(qū)2010年-2011年的2228份豬血清樣品進(jìn)行了EMCV抗體檢測(cè)，結(jié)果，被檢豬場(chǎng)的陽性率為100％，被檢血清樣品的陽性率為91.47％，其中仔豬的血清陽性率為43.14％，后備母豬的血清陽性率為84.7％,育成豬的血清陽性率為91.67％。表明廣西地區(qū)豬群已經(jīng)普遍感染EMCV。
　　 結(jié)果表明，本研究成功表達(dá)了豬EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1，建立了基于VP1蛋白的間接ELISA方法，開展了廣西地區(qū)豬群EMCV感染