腦心肌炎病毒轉(zhuǎn)錄組分析及穩(wěn)定表達(dá)先導(dǎo)蛋白N2a細(xì)胞系的建立.pdf

1、豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一種重要的人畜共患性傳染病，該病以腦炎、心肌炎、心肌周圍炎以及母豬繁殖障礙為主要特征。目前對EMCV的分子致病機制及相關(guān)蛋白功能的了解不夠深入，缺乏理論依據(jù)。本研究旨在探究EMCV對于小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a)轉(zhuǎn)錄組的影響，探索基因表達(dá)與致病性之間的關(guān)聯(lián)，揭示EMCV感染后的分子機制。此外，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EMCV先導(dǎo)(Leader,L)

2、蛋白的細(xì)胞模型，為進一步闡明EMCV的致病機制及深入研究L蛋白的功能提供科學(xué)依據(jù)。
　　用自河北省分離的EMCV BD2（GenBank序列號:KF709977）毒株感染N2a細(xì)胞，收集感染后7h的細(xì)胞樣本，分別提取EMCV感染組和正常細(xì)胞對照組兩組樣本的總RNA，使用NimbleGen雜交體系將標(biāo)記好的ds-cDNA與小鼠基因表達(dá)譜芯片雜交，然后洗滌，使用Axon GenePix4000B microarray scanner對

3、芯片進行掃描，獲得差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對篩查出的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進行聚類分析、GO分析以及KEGG通路分析，篩選差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因及信號通路。利用Real-time FQ-PCR方法，對微陣列數(shù)據(jù)結(jié)果進行驗證。結(jié)果表明，EMCV感染N2a細(xì)胞7h共有21143個基因被鑒定為差異表達(dá)基因。這些基因參與多種重要反應(yīng)，主要包括免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，凋亡，防御反應(yīng)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，且與干擾素相關(guān)的差異表達(dá)基因均有明顯上調(diào)，提示干擾

4、素在宿主抗病毒感染過程發(fā)揮重要作用。通路分析表明，篩選差異表達(dá)的主要信號通路包括PI3KAkt信號通路，MAPK信號通路，細(xì)胞因子間相互作用，趨化因子信號通路，TCR，RLR信號通路和細(xì)胞凋亡通路等，表明EMCV感染7h后，宿主啟動不同策略來激活免疫、炎癥反應(yīng)等以對抗感染。對10個差異表達(dá)基因進行Real-time FQ-PCR，結(jié)果表明，微陣列分析結(jié)果能夠良好的反應(yīng)基因表達(dá)的總體變化。
　　應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法，將表達(dá)EM

5、CV L蛋白的重組質(zhì)粒pNTAP-B-L轉(zhuǎn)染至單層N2a細(xì)胞中，通過篩選具有G418抗性的單細(xì)胞克隆，以有限稀釋法篩選單細(xì)胞克隆，擴增培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)TAP tag-L融合蛋白的N2a細(xì)胞系;利用RT-PCR、Western blotting和間接免疫熒光試驗(IFA)對融合蛋白TAP tag-L的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位情況進行鑒定，將表達(dá)為陽性的細(xì)胞克隆命名為N2a-TAP-L細(xì)胞系。結(jié)果表明，EMCV的L基因成功整合至N2a細(xì)胞基因組D