穩(wěn)定表達(dá)豬CD163的PAM細(xì)胞系的建立.pdf

1、CD163是SRCR蛋白超家族的一員，為典型的Ⅰ型糖基化膜蛋白，因富含半胱氨酸，內(nèi)部可以形成的9個(gè)由二硫鍵連接的構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域。研究表明CD163與PRRSV感染密切相關(guān)，其作為PRRSV的受體介導(dǎo)病毒的脫衣殼和病毒核酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的釋放。豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）為PRRSV的靶細(xì)胞，目前通過(guò)SV40 Large T抗原轉(zhuǎn)染原代PAM細(xì)胞構(gòu)建了3個(gè)傳代細(xì)胞系，但均不支持PRRSV感染，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系無(wú)CD163表達(dá)。本研究旨在通過(guò)含CD16

2、3基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染傳代PAM細(xì)胞系，使其表達(dá)CD163，以期獲得能夠支持PRRSV感染的細(xì)胞系。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 ⑴CD163基因全長(zhǎng)克隆獲得及重組真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定。根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬CD163基因序列設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增豬CD163開(kāi)放閱讀框序列的特異性引物。由實(shí)驗(yàn)室保存原代豬肺泡巨噬細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出3348bp的目的片段，并將其克隆到pMD19-T載體，經(jīng)PCR，酶切和

3、測(cè)序證明為豬CD163序列。鑒于擴(kuò)增過(guò)程中CD163 cDNA中有5個(gè)位點(diǎn)的堿基突變引起相應(yīng)的氨基酸的改變，使用TaKaRa公司的點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⑺婕暗膲A基加以突變修飾。將基因片段克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4.0和pIRES載體上，通過(guò)酶切鑒定確定重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 ⑵豬CD163的PRRSV受體的功能。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD163瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PRRSV的非敏感細(xì)胞系BHK-21和PK-15，

4、利用RT-PCR方法和間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CD163在細(xì)胞上的表達(dá)，然后進(jìn)行病毒增殖試驗(yàn)，對(duì)比轉(zhuǎn)染CD163前后細(xì)胞對(duì)PRRSV敏感性的變化。以驗(yàn)證豬CD163作為PRRSV受體，僅表達(dá)CD163就能夠使得非敏感細(xì)胞系對(duì)PRRSV敏感的論斷。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pIRES-CD163后的BHK-21和PK-15細(xì)胞中均表達(dá)了CD163，并且這些轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠增殖PRRSV并產(chǎn)生子代病毒。
　　 ⑶穩(wěn)定表達(dá)CD163的PAM細(xì)胞系的建立。本

5、實(shí)驗(yàn)旨在使用重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4.0-CD163瞬時(shí)轉(zhuǎn)染豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/21(CRL-2843)，經(jīng)RT-PCR方法和間接免疫熒光技術(shù)確定CD163在細(xì)胞上的表達(dá)后，添加zeocin進(jìn)行抗性篩選，采用有限稀釋法，經(jīng)過(guò)3輪篩選獲得8株陽(yáng)性克隆，分別命名為3G10-C2，3G10-D2，3G10-F2，3G10-B3，3G10-D4，3G10-B6，3G10-A8，3G10-H8。該8個(gè)陽(yáng)性克隆陽(yáng)性率均在90％以上。使用RT