穩(wěn)定表達αvβ3細胞系的建立及其對口蹄疫病毒易感性的評價.pdf

1、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是單股正鏈RNA病毒，屬于微RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，F(xiàn)MDV對偶蹄動物高度致病，包括牛、水牛、豬、山羊、綿羊及多種野生物種。病毒識別受體是病毒感染的第一步，決定著病毒感染細胞的類型和宿主嗜性。FMDV可以識別不同受體，然后介導不同的路徑進入細胞。FMDV通過識別位點RGD結合整聯(lián)蛋白受體（αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8）后，通過網(wǎng)格蛋白介導的內

2、吞路徑進入細胞;FMDV還可以同VP3第56位精氨酸(VP3056R)結合硫酸乙酰肝素受體，通過小窩蛋白介導的內吞路徑進入細胞。整聯(lián)蛋白受體除了介導病毒感染作用外，還具有介導或激發(fā)信號轉導等多種作用，這些功能參與病毒的致病機制還不清楚。因此，本研究為了揭示單個受體對病毒感染和信號介導的作用，構建單個受體細胞系，為進一步深入研究奠定基礎。本研究克隆了整聯(lián)蛋白受體αvβ3基因，并構建了穩(wěn)定表達αvβ3的CHO-677-αvβ3細胞系，并評價

3、了對口蹄疫病毒的易感性，具體內容如下:
　　(1)αv和β3亞基的克隆:從乳鼠肺組織中分別提取了整聯(lián)蛋白受體αv和β3亞基基因組總RNA，根據(jù)GenBank中已公布的整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因序列，分別設計合成兩對特異性引物，RT-PCR擴增出鼠源整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因，產物經膠回收純化后分別與pGEM-T載體相連，構建重組質粒，并進行多序列比對分析。結果表明，鼠源整聯(lián)蛋白αv亞基基因全長3135bp，編碼1045個氨基酸，β

4、3亞基基因全長2364bp，編碼788個氨基酸。序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，鼠源αv亞基基因與人、豬同源性較高，而β3亞基基因與牛和綿羊的同源性較高。
　　(2)αv和β3蛋白表達及其多抗的制備:將擴增的αv和β3部分胞外域基因分別與原核表達載體pET-30a相連，構建原核表達質粒，測序確認讀碼框正確后，將其轉化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，以IPTG誘導表達重組融合蛋白。通過SDS-PAGE鑒定后提取包涵體，以電泳分離純化的重組融合蛋白

5、免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，以Western blot鑒定血清特異性。結果顯示，實現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達，SDS-PAGE顯示分子量分別為40 kDa和40 kDa，主要以包涵體形式存在于菌體中，該血清可與目的蛋白發(fā)生特異性反應。
　　(3)穩(wěn)定表達αvβ3細胞系建立:用高效慢病毒介導的基因轉導技術，構建了穩(wěn)定表達αvβ3異二聚體的CHO-677細胞系，用PCR和IFA分別從基因和蛋白水平檢測了第二十代細胞系中

6、αv和β3亞基的表達，表明該基因已經成功的導入CHO-677細胞并穩(wěn)定表達。
　　(4)對口蹄疫病毒易感性的評價:為了評價該細胞系對口蹄疫病毒易感性，用蝕斑實驗、TCID50、實時熒光定量和間接免疫熒光實驗比較分析口蹄疫病毒在細胞系和親本細胞上的生物學特性差異，結果表明感染FMDV/O/ZK/93之后，與親本細胞相比，CHO-677-αvβ3細胞系上病毒RNA水平和蛋白表達量顯著提高。數(shù)據(jù)表明成功構建了穩(wěn)定表達αvβ3的細胞系，并