檢測口蹄疫病毒單抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表達.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的偶蹄動物共患的急性接觸性傳染病，人也可以感染。本病有極強的傳染性，可形成大范圍流行，造成巨大的經濟損失和政治影響。預防和控制該病的關鍵是高效疫苗和準確的診斷方法的應用。目前用于口蹄疫的診斷技術種類很多，而傳統(tǒng)ELISA大多用于檢測抗體，其抗原需要完整的病毒，生產過程需要昂貴的培養(yǎng)基，成本高，且

2、存在散毒的危險。檢測病毒是確診病毒感染的標準，單抗具有特異性高的特點，因此基于單抗而建立的診斷方法具有重要的應用前景。此外，有研究表明，將口蹄疫具有免疫原性的結構蛋白基因和裂解酶基因(3C基因)連接起來構建的多抗原基因表達載體，表達后與單一的免疫原性基因相比，具有較高的免疫原性。本研究開展了抗口蹄疫病毒單克隆抗體的制備及初步應用研究和口蹄疫病毒免疫原蛋白在大腸桿菌的融合表達。 1抗O型口蹄疫病毒單克隆抗體的制各和初步應用以純化的

3、O型FMDV為免疫原，免疫BALB/C小鼠，將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，用ELISA篩選獲得2株分泌抗O型FMDV單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細胞，分別命名為2G12和2G8。染色體數目分析證明為雜交產物，免疫熒光試驗證明兩株單抗均能特異性地與FMDV反應。選擇其中效價較高的1株(2G12)用于下列實驗。以自行制備的兔抗FMDV高免血清IgG為捕獲抗體，包被酶聯免疫吸附試驗微量反應板，以單抗2G12為檢測抗體，建立了快速檢測F

4、MDV抗原的雙抗體夾心ELISA。該方法能檢出90ng/100μLFMDV病毒，與豬瘟病毒(HCV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合癥耳病病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PrV)、豬細小病毒(PPV)和乙腦病毒(JEV)均不起反應。本研究為檢測口蹄疫病毒抗原提供了靈敏和特異的方法。 2口蹄疫病毒多抗原基因(VP1-VP3-3C)在大腸桿菌中的融合表達應用PCR擴增技術獲得1564bp的片段，包含口蹄疫病毒VP1全長基因、VP3部分基因和編

5、碼3C裂解酶的全長基因，連接到pMD-18T載體上，在獲得重組質粒pMD-18T-VP1-VP3-3C后，進行序列分析；將此片段連接到Pgex-KG載體，構建了重組表達質粒pKG-VP1-VP3-3C，將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導表達，收集菌體進行SDS-PAGE電泳，結果表明，VP1-VP3-3C基因在大腸桿菌中獲得成功表達，其表達產物為分子量83KDa的融合蛋白，并且能與豬抗FMDV血清發(fā)生特異性反