亞歐型與南非型口蹄疫病毒多重實(shí)時熒光RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、口蹄疫( Foot-and-mouth disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄獸，偶見于人和其他動物。由于FMDV是單股RNA病毒，有很高的變異能力，其抗原性的變異非常頻繁，故給口蹄疫的防制帶來了很大的困難?？焖贉?zhǔn)確地診斷FMD對于及時控制撲滅疫情極其重要，因此，F(xiàn)MDV快速檢測方法一直都是各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題

2、。
　　 口蹄疫分為7個血清型（O、A、C、亞洲Ⅰ型、南非1、2、3型），鑒于目前我國發(fā)生的口蹄疫疫情主要是由亞歐型（A、O及Asia-Ⅰ型等）口蹄疫病毒引起的，本試驗(yàn)從Genebank中獲得7種血清型FMDV RNA基因組序列，應(yīng)用MegALign軟件分析其序列，根據(jù)Taqman探針設(shè)計原則，利用軟件Beacon designer7.0在5’端非翻譯區(qū)保守區(qū)設(shè)計亞歐型（Prime:L6/U6;Probe:P6）與南非型（Pri

3、me:AY48U/AY48L;Probe:AY48P）特異的引物與探針，建立了快速檢測亞歐型與南非型FMDV的多重實(shí)時熒光PCR方法，同時將目的片段插入T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，為所建立的多重?zé)晒釶CR方法提供陽性物質(zhì)，特異性試驗(yàn)顯示，2套引物/探針可以有效區(qū)分亞歐型與南非型代表株，敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在多重?zé)晒釶CR體系下，檢測亞歐型及南非型陽性質(zhì)粒的靈敏度可達(dá)20個拷貝。同時用梯度稀釋的質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍較寬（2.0×107-2

4、.0×10拷貝），亞歐型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率92.9％，相關(guān)系數(shù)為0.991，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.506x+41.697;南非型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率91.8％，相關(guān)系數(shù)為0.992，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.535x+42.935，曲線斜率和擴(kuò)增效率均可滿足定量要求。
　　 為了更快速、簡便的檢測亞歐型與南非型FMDV，建立了一步法多重Real TimeRT-PCR方法。為獲得熒光RT-PCR檢測方法的陽性模板，在上游引物U6、A

5、Y48L的5’端導(dǎo)入T7啟動子序列，PCR擴(kuò)增后得到帶有T7啟動子序列的產(chǎn)物片段，利用Promega公司體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cRNA，對生成的cRNA進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)，確定無質(zhì)粒DNA殘留；同時對Script Reverse Transcriptase酶、引物/探針濃度與退火溫度等進(jìn)行了優(yōu)化，確定了反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，對倍比稀釋的cRNA進(jìn)行敏感性檢測，南非型FMDV最低可檢測至7.6×10-9rig/μL，亞歐型FMDV最低可檢測值為6.3