馬鈴薯病毒多重RT-PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文馬鈴薯病毒多重RTPCR檢測技術(shù)研究姓名：袁青申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：譚萬忠王中康20040501西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文反轉(zhuǎn)錄酶，lu重組Taq酶，0.5mmolLdNTPs，病毒下游引物0.5I1molL。二重加入2.5mmolLMgC121.OmmolLdNTPs多重RTPCR反應(yīng)中加入3.5mmolLMgCl210URNA酶抑制劑，100uMMLV反轉(zhuǎn)錄酶，1.5mmo1LdNTPs。

2、單重和二重反應(yīng)條件為250C10min42C30min950C2min940C30s60C30s72C30S，共30個循環(huán)，最后721C10min。多重反應(yīng)條件為25C10min42C45min95C2min94C30s600C30s72Clmin，共30個循環(huán)，最后720C10min.5.擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性驗證:切膠回收PVYPVX.PVAPVSPLRVRTPCR擴增產(chǎn)物，分別克隆到pMD18T載體中，通過PCR驗證得到的陽性克隆(白色

3、菌落)分別含有以上5種病毒的靶序列cDNA提取質(zhì)粒測序，經(jīng)用NCBIBLAST比對，結(jié)果表明擴增的5種馬鈴薯病毒靶帶的序列與已知基因的靶序列完全一致，表明RTPCR擴增產(chǎn)物準(zhǔn)確無誤。6.RTPCR檢側(cè)性能測定:采用馬鈴薯5種病毒的引物對經(jīng)RTPCR擴增天竺葵皺縮花葉病毒，南瓜花葉病毒，番茄花葉病毒，蜀葵花葉病毒的RNA，不產(chǎn)生任何DNA條帶，而陽性對照有特異性靶帶，陰性對照無任何DNA條帶產(chǎn)生。紫外分光光度計測定蛋白酶K法提取的PVX病

4、毒總RNA含量為56.04nglul，稀釋100倍后仍能檢測到靶帶。將浸提法提取的病毒總RNA稀釋32倍以后也能擴增出靶帶。以不同的PCR儀及不同的擴增方式對樣品進行擴增，結(jié)果表明都能擴增出靶帶，擴增結(jié)果差別不明顯。7.固相化檢測試劑盒研制與應(yīng)用:基于馬鈴薯病毒病RTPCR優(yōu)化的試劑配方，加入專有的生物活性分子穩(wěn)定劑制成的固相化預(yù)混試劑，經(jīng)真空冷凍干燥后制成固相化檢測試劑盒，可以在常溫條件下密封保存，每月以靶病毒測定擴增效果。檢測結(jié)果表

5、明，試劑盒在常溫下至少可以保存6個月，檢側(cè)穩(wěn)定性、靈敏度和特異性等各項指標(biāo)均無明顯改變。運用分子檢@V9試劑盒對溫室接種的幾種馬鈴薯病毒進行檢測，結(jié)果顯示接種的病毒都能檢測出來。采集田間具皺縮花葉癥狀的樣品，檢測結(jié)果樣品都帶有病毒。采用多重RTPCR檢測試劑盒，對來自四川、重慶等15縣市248個田間與苗圃馬鈴薯種薯種苗樣品實際檢測并與酶聯(lián)免疫測試法(EIISA)相比較，結(jié)果表明，其靈敏度高于ELISA法約100倍。關(guān)鍵詞:MRTPCR檢