山東和陜西蘋果病毒病病原鑒定及多重RT-PCR檢測體系的建立.pdf

1、本研究于2012年4月和7月先后從山東和陜西分別采集了54份和50份蘋果葉片樣品。從文獻中篩選了蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)，蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，蘋果綠皺果病毒(Apple green crinklevirus，AGrCV)，蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)，蘋果莖溝病毒(Apple stem groovi

2、ng virus，ASGV)和蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus，ACLSV)等5種蘋果病毒類病原物的特異性引物，對山東和陜西部分隨機挑選的樣品進行檢測，結果顯示，除ApMV檢測呈陰性外，從部分樣品中均檢測到其余4種病原的特異性條帶，將擴增得到的基因片段進行克隆測序和序列分析，明確了樣品受到ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的侵染。根據(jù)RT-PCR檢測結果和測得的基因序列，結合GenB

3、ank中已報道的相關病毒的基因序列，設計擴增這4種病毒類病原物的特異性引物，經(jīng)過篩選，并經(jīng)擴增體系和擴增條件的優(yōu)化，最終建立了同時擴增ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的多重RT-PCR體系。對該檢測體系進行了特異性和靈敏性測試，結果表明，多重RT-PCR擴增的特異性強，能同時檢測出4種病毒類病原物的最低檢出限為10-2 ng級。利用該多重RT-PCR選取了100份采自山東和陜西蘋果葉片樣品進行了檢測，檢測情況表明，在青島、煙臺

4、、渭南和咸陽4個地區(qū)的樣品中均檢測出4種病毒類病原，其中山東地區(qū)優(yōu)勢病毒種為ASPV，青島和煙臺的檢出率分別為88.9％和84.4％，而陜西地區(qū)的優(yōu)勢種為ASGV和ASPV，渭南和咸陽ASGV檢出率分別是81.0％和79.3％，ASPV檢測率也分別是81.0％和79.3％。ACLSV在4個地區(qū)樣品中的檢測率相對較低。4個地區(qū)所采集的樣品中病毒復合侵染現(xiàn)象嚴重，其中青島、煙臺、渭南和咸陽樣品中復合侵染率分別為66.7％，75.0％，85.

5、7％和89.7％。青島、煙臺、渭南和咸陽的最主要的復合侵染類型分別為ACLSV+ASPV+ASSVd、ASGV+ASPV、ASGV+ASPV+ASSVd和ASGV+ASPV+ASSVd。
　　為研究ACLSV病毒的變異情況，將ACLSV全長序列分為6段進行擴增，分別得到了2435 bp、1435 bp、861 bp、1605 bp、1095 bp和749 bp的基因片段，經(jīng)過測序分析，確認基因序列正確，經(jīng)DNAStar SeqMa

6、n進行拼接得到ACLSV基因組7557 bp全長序列（登錄號KJ522693）。該全基因組包含3個開放閱讀框，分別編碼RNA聚合酶、運動蛋白和外殼蛋白，5'UTR和3UTR分別有151 nt和195 nt的非編碼區(qū)。經(jīng)全基因組構建進化樹分析，該ACLSV全序列與日本的蘋果分離物B6序列(GenBank no.AB326224)核苷酸相似性最高，為85.9％。
　　本文研究了ASGV外殼蛋白基因(CP)的原核表達。將ASGV CP的

7、克隆重組載體和表達載體pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ于37℃酶切反應過夜，純化回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶4℃連接反應過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中繁殖，經(jīng)菌液酶切和PCR鑒定，挑選陽性克隆的菌液測序驗證，測序結果表明，目的片段ASGV CP正確克隆到表達載體pET-28a(+)中，說明原核表達載體構建成功。提取已構建成功的原核表達載體pET-28a-ASGV-CP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3