禽偏肺病毒的分離鑒定及Nested RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，aMPV)，是家禽常見的呼吸道病原之一。aMPV感染火雞可引起火雞鼻氣管炎，感染產(chǎn)蛋雞可導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低。aMPV也被認(rèn)為是肉雞腫頭綜合征(Swollen head syndrome，SHS)的重要誘發(fā)因素之一。
　　 aMPV于1978年首次在南非報(bào)道之后，歐洲、亞洲等地陸續(xù)出現(xiàn)該病毒的相關(guān)報(bào)道。aMPV可以分為A、B、C、D4個(gè)亞型，其中A亞型和B亞型在世界各

2、地廣泛報(bào)道，C亞型和D亞型分別在美國和法國報(bào)道。
　　 中國大陸地區(qū)僅于1999年報(bào)道分離到1株禽偏肺病毒;2007-2008年的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示山東某些地區(qū)種雞血清學(xué)陽性率可達(dá)100％;2009-2010年，孫靜等利用地高辛標(biāo)記的核酸探針對山東省部分地區(qū)臨床健康肉雞群的多種呼吸道病原進(jìn)行檢測，aMPV檢出率高達(dá)36.87％，而且多重感染現(xiàn)象嚴(yán)重，aMPV對養(yǎng)禽業(yè)的危害不容忽視。本研究使用建立的aMPV Nested RT-P

3、CR檢測方法，對aMPV進(jìn)行了分離鑒定，并對分離株的部分特性進(jìn)行了初步研究，從而為該病的預(yù)防控制提供理論依據(jù)。本研究內(nèi)容主要分為兩部分:
　　 1、禽偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測方法的建立和應(yīng)用
　　 本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的B亞型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列設(shè)計(jì)兩對特異性引物，建立了一種檢測B亞型禽偏肺病毒的逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測方法。應(yīng)用該方法對B亞型禽偏肺病毒山東地區(qū)分離株進(jìn)行檢測，能夠特異性地

4、擴(kuò)增出415bp的目的片段。該方法具有高度特異性和敏感性。分別以新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。經(jīng)過檢測，第一次PCR擴(kuò)增的敏感性為107 copies/μL，第二次擴(kuò)增的敏感性可達(dá)到102copies/μL，第二次擴(kuò)增的敏感性比第一次高105倍。應(yīng)用該方法對采自山東省不同地區(qū)的142份具有呼吸道癥狀的臨床病例進(jìn)行aMPV檢測，最終從中檢測出75份為陽性。試驗(yàn)結(jié)果表明

5、，建立的逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測方法特異、敏感、實(shí)用，為B亞型禽偏肺病毒的快速診斷及深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、禽偏肺病毒SDWF株的分離鑒定及特性的初步研究
　　 從山東省部分地區(qū)的商品肉雞中采集禽偏肺病毒臨床疑似病料，并進(jìn)行RT-PCR檢測，篩選出禽偏肺病毒陽性病料作為分毒材料。將陽性病料接種SPF雞胚，盲傳至第7代時(shí)雞胚生長明顯遲滯，胚體矮小。取陽性尿囊液在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上傳代培養(yǎng)，出現(xiàn)禽偏肺病毒典型細(xì)胞

6、病變(CPE):細(xì)胞變圓、懸浮，并且有合胞體形成。分離株能夠在Vero細(xì)胞上生長，并于攻毒后48 h左右觀察到部分細(xì)胞圓縮、懸浮，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，圓縮的細(xì)胞逐漸增多;攻毒72 h后可以觀察到典型的合胞體。將分離株接種于DF-1細(xì)胞，觀察到類似細(xì)胞病變。采用終點(diǎn)稀釋法對病毒液進(jìn)行初步純化，并對其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將病毒液接種于DF-1細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，可以在胞質(zhì)中觀察到特異的綠色熒光，胞核沒有觀察到熒光;陰性對照組未出現(xiàn)熒光。

7、>　　 對出現(xiàn)典型細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR鑒定，可以觀察到415 bp的特異性目的條帶;將PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化后測序，并與Genbank中發(fā)表的F基因序列比較，結(jié)果與B亞型禽偏肺病毒核苷酸同源性最高，達(dá)97.4％-99.3％;與A亞型禽偏肺病毒核苷酸同源性較低，為77.4％-78.1％;而與C亞型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低，為69.5％-69.7％?；蚍中徒Y(jié)果最終顯示分離株為B亞型禽偏肺病毒，將其命名為B亞型禽偏肺病毒S

8、DWF株。
　　 病毒的核酸類型試驗(yàn)結(jié)果表明SDWF株為RNA病毒。血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株不能凝集健康雞的紅細(xì)胞以及鴨的紅細(xì)胞。理化學(xué)特性研究結(jié)果表明分離株對脂溶性溶劑乙醚、氯仿敏感，為具有囊膜的病毒;對酸性環(huán)境有一定的抵抗力;60℃1 h可使毒株失活。測定分離株的雞胚成纖維細(xì)胞半數(shù)感染量，按照Reed-Muench方法計(jì)算SDWF株的TCID50為10-3.3/0.1 mL。SPF雞攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株可以引起雞的呼吸道癥