番茄褪綠病毒RT-PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化應(yīng)用及肥城桃2種病毒的鑒定.pdf

1、植物病毒病嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，在蔬菜和果樹上尤為嚴(yán)重，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒在侵染寄主植物后，造成植株代謝異常，果實(shí)減少或畸形，甚至絕收。本研究主要以蔬菜上的番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）及果樹上的李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）和李樹皮壞死莖紋孔伴隨病毒（Plum bark necrosis stem pitting-associat

2、ed virus，PBNSPaV）為研究對(duì)象，目的是優(yōu)化ToCV RT-PCR檢測(cè)方法，為日后檢測(cè)該病毒提供參考依據(jù)；同時(shí)，摸清河南設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)ToCV以及山東肥城桃主產(chǎn)區(qū)PNRSV和PBNSPaV的發(fā)生情況，了解系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
　　通過對(duì)ToCV RT-PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化表明：ToCV特異性引物To-CP（F/R）的靈敏度和特異性最好，該引物能在退火溫度37~64℃、引物濃度4~10 pmol/μL的區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到ToCV的特

3、異性片段；引物To-HSP（F/R）可以一次性擴(kuò)增HSP70基因的全長(zhǎng)序列。優(yōu)化后的RT-PCR擴(kuò)增效果相對(duì)穩(wěn)定；設(shè)計(jì)了同時(shí)擴(kuò)增ToCV HSP70和CP基因的雙重PCR體系，能有效縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
　　對(duì)河南省ToCV發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查與檢測(cè)，結(jié)果顯示：河南番茄主產(chǎn)區(qū)采集的90份疑似感病番茄樣品中，檢出陽(yáng)性樣品39份，將得到的分離物序列（GenBank登錄號(hào)KP264983/KP2649865、KP264984/KP9264987、

4、KP264985/KP264988）用于序列一致性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明：本研究的分離物均與日本分離物的一致性最高，親緣關(guān)系最近。同時(shí)提取ToCV病毒粒子，經(jīng)負(fù)染色后，觀察到ToCV完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　利用RT-PCR技術(shù)，對(duì)肥城桃主產(chǎn)區(qū)采集的158份桃樹葉片樣品，進(jìn)行PNRSV和PBNSPaV的檢測(cè)與鑒定，結(jié)果顯示：PNRSV和PBNSPaV陽(yáng)性樣品的檢出數(shù)量分別為9份和11份，將得到的分離物序列（GenBank登錄號(hào)K