南非型口蹄疫病毒常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）所引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性系統(tǒng)性水泡病。FMDV為RNA病毒，分7個(gè)血清型，即A、O、C、Asial（統(tǒng)稱為亞歐型）和南非型（SAT）1、2、3（統(tǒng)稱為南非型）。FMDV SAT具有特別明顯的地域性，主要局限于非洲地區(qū)。但據(jù)近幾年報(bào)道，SAT FMDV在中東地區(qū)出現(xiàn)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了潛在的威脅。因此有必要建立簡(jiǎn)單、快速、特異、靈敏的SAT FMDV的診斷方法，以作為一種戰(zhàn)略儲(chǔ)備技術(shù)。
　

2、　本研究旨在建立起一種SAT FMDV常規(guī)RT-PCR診斷方法，而VP1編碼區(qū)基因1D是進(jìn)行FMDV分型的依據(jù)，具有血清型的特異性，而非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)2B保守性較好，所以本試驗(yàn)通過(guò)分析比較最終把SAT FMDV診斷靶區(qū)域定位于FMDV的1D2A2B區(qū)域。由于我國(guó)歷史上沒(méi)有SAT FMD，為了保障生物安全性并滿足實(shí)驗(yàn)需要，在比較分析SAT FMDV核酸序列同源性基礎(chǔ)上，挑選出8個(gè)SAT1型、10個(gè)SAT2型和3個(gè)SAT3型的代表毒株，合成

3、該些毒株的1D2A2B基因，并構(gòu)建出相應(yīng)的重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定分析正確后用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　引物設(shè)計(jì)為建立RT-PCR方法的關(guān)鍵，而SAT FMDV的1D基因變異度大（70％-85%），所以，復(fù)合引物為本試驗(yàn)的最優(yōu)選擇。通過(guò)3個(gè)SAT型代表毒株1D2A2B序列的分析與比較，選取了1D基因3’端作為上游引物設(shè)計(jì)的靶區(qū)域，下游引物在保守性較好的2B區(qū)。通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)，最終篩選出一套由7條上游引物和1條下游引物組成的復(fù)合引物，命名為SAT-D

4、8。
　　以上述重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，SAT-D8為引物對(duì)，首先在DNA水平上建立了FMDV SAT-D8 RT-PCR檢測(cè)方法。以上述21個(gè)質(zhì)粒為模板，都能特異性地?cái)U(kuò)增出257bp的目的條帶。進(jìn)一步通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄法制備出21個(gè)毒株1D2A2B基因的RNA轉(zhuǎn)錄本，以此為模板，也都能夠擴(kuò)增出特異的目的條帶。該方法不與A、O、C和AsiaI型 FMDV以及BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PR

5、V、PPV、PCV等病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。以質(zhì)粒為模板，該方法的靈敏度可達(dá)到102拷貝數(shù)/微升，以RNA轉(zhuǎn)錄本為模板，靈敏度為103-104拷貝數(shù)/微升，比DNA水平上的靈敏度低10-100個(gè)拷貝數(shù)/毫升。
　　以3份源自英國(guó)Pirbright實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性滅活抗原SAT1/2/3和125份源自我國(guó)牛豬羊的心、肝、脾、肺、腎、舌面組織及血清作為待檢樣品，提取其RNA后，進(jìn)行SAT-D8 RT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，以SAT1/2/3滅活

6、抗原 RNA為模板，擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的SAT FMDV陽(yáng)性條帶。陽(yáng)性條帶的進(jìn)一步序列分析表明為SAT型。其它125份田間樣品檢測(cè)結(jié)果全為SAT陰性。在建立了FMDV SAT-D8常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，組裝了相應(yīng)的試劑盒，-20℃保存，定期取出檢測(cè)。在保存至第6個(gè)月時(shí)試劑盒穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)還需要大量的田間樣品，尤其是SAT陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證，以及在更長(zhǎng)保質(zhì)期條件下的試劑盒穩(wěn)定性檢測(cè)。
　　通過(guò)上述試驗(yàn)，本研究成功地建立了FMDV