小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及F基因的分子特性研究.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus，PPRV)引起，以發(fā)熱，眼、鼻有大量漿性分泌物、潰瘍和壞死性口腔炎，胃炎，腹瀉和肺炎為特征。2007年7月，我國(guó)西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣發(fā)生PPR疫情，這是我國(guó)首次發(fā)生PPR，死亡262只山羊和綿羊。作為一種OIE法定報(bào)告的動(dòng)物疾病，PPR嚴(yán)重威脅著我國(guó)的動(dòng)物

2、衛(wèi)生安全和我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，是需要采取嚴(yán)厲的強(qiáng)制預(yù)防，控制和撲滅的動(dòng)物疫病之一。本研究建立了檢測(cè)PPRV的快速、特異的基于Taqman的一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，以期快速檢測(cè)PPRV，并對(duì)PPRV F基因的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。 通過(guò)對(duì)GenBank已公布的印度，土耳其和尼日利亞等國(guó)家發(fā)表的PPRV F基因序列進(jìn)行序列比較分析，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一條Taqman探針。利用這對(duì)引物和探針對(duì)PPRV熒光定量RT-P

3、CR檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的條件能擴(kuò)增出標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性曲線。 針對(duì)類似檢測(cè)方法中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際檢測(cè)的樣品有一定差異而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確等問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)了體外轉(zhuǎn)錄法制備標(biāo)準(zhǔn)品的方法。在熒光定量RT-PCR正向引物的5’端加上T7啟動(dòng)子后與反向引物擴(kuò)增PPRV毒株Nigeria75/1細(xì)胞培養(yǎng)液RNA，切膠回收目的條帶作為體外轉(zhuǎn)錄的模板，體外轉(zhuǎn)錄后測(cè)RNA濃度以及OD值。體外轉(zhuǎn)錄的RNA經(jīng)過(guò)10倍梯度稀釋后即為建立該方法的cRNA標(biāo)

4、準(zhǔn)品。試驗(yàn)結(jié)果表明，此標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的線性范圍，并具有良好的穩(wěn)定性，在-80℃保存半年后無(wú)顯著變化。以4.9×103～4.9×108 copies/μl標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用本研究中設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9997。本方法具有高度靈敏性，最低可檢測(cè)到490 copies/μl的RNA模板。組內(nèi)和組間重復(fù)的變異系數(shù)分別為0.13％～0.5％和0.44％～1.71％。對(duì)來(lái)自不同疫源地

5、的PPRV RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，都獲得了特異性擴(kuò)增，但是，不與牛瘟病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。用該方法和普通RT-PCR同時(shí)檢測(cè)病料的組織RNA，該方法比普通RT-PCR的靈敏度高100倍。 從西藏PPR疫區(qū)采取的羊的各臟器和血液中提取總RNA，用該熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用已經(jīng)建立的針對(duì)N基因的熒光定量RT-PCR、針對(duì)N基因的普通RT-PCR、針對(duì)F基因的普通RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，兩種熒光定量RT-PCR檢

6、出率相當(dāng)，而這兩種方法比針對(duì)N基因和F基因的普通RT-PCR陽(yáng)性檢出率都要高。 對(duì)我國(guó)西藏PPRV China/Tib/Gej/07-30進(jìn)行F基因序列測(cè)定，并進(jìn)行分子生物學(xué)特征分析。首先應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增出F基因片段，對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，然后對(duì)測(cè)定的核苷酸和推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析。我國(guó)西藏PPRVChina/Tib/Gej/07-30的F基因由2411個(gè)核苷酸組成，編碼546個(gè)氨基酸，與其他分離株核苷酸和氨

7、基酸序列同源性分別為85.5-96.1％和94.3-98.2％。PPRVChina/Tib/Gej/07-30 F蛋白含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，序列高度變異。F蛋白104-108位和109-133位氨基酸位點(diǎn)分別是高度保守的裂解位點(diǎn)和融合肽結(jié)構(gòu)域。F蛋白還含有三個(gè)七肽重復(fù)區(qū)，序列高度保守。China/Tib/Gej/07-30的F基因5'UTR區(qū)長(zhǎng)度為634個(gè)核苷酸，GC含量高達(dá)70.0％，與其他PPRV毒株序列相似性為76.2-9