狐源CDV H、F、N基因序列分析及其TaqMan熒光定量RT-PCR診斷方法的建立.pdf

1、為進(jìn)一步研究犬瘟熱病毒的防控與診斷，本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，分別設(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增CDVH基因、F基因和N基因的三對(duì)引物。采用RT-PCR分別擴(kuò)增了狐源CDV泰安株(CDV-FOX-TA)的H基因、F基因和N基因，并將其分別克隆進(jìn)pMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定與分析。此外本研究還設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物與TaqMan探針，對(duì)反應(yīng)體系與條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)CDV的方法，試驗(yàn)結(jié)果表明： 1.CD

2、V-FOX-TAH基因含有1個(gè)ORF，全長(zhǎng)1824bp，共編碼607個(gè)氨基酸，與CDV-A75/17株和部分野毒株編碼的氨基酸數(shù)量相同，與CDV-Onderstpoort編碼的604個(gè)氨基酸不同。CDV-FOX-TAH基因終止密碼子不是AUU而是UGA。其上存在8個(gè)潛在的天冬酰氨糖基化位點(diǎn)，與野毒株和疫苗株均不同，與CDV-Onderstlooort、CDV-Convac、CDV-A75/17、CDV-LP的同源性分別為89.2％、90

3、.6％、98.6％和98.7％。 2.CDV-FOX-TA的F基因含有1個(gè)ORF，全長(zhǎng)1889bp，共編碼662個(gè)氨基酸。有4個(gè)翻譯起始密碼子，其中3個(gè)位于閱讀框內(nèi)，1個(gè)位于閱讀框外，CDV-FOX-TAF基因翻譯起始密碼子不是第1個(gè)或第2框內(nèi)ATG，因其461-463位置不是ATG而是AUA，而是可能利用與CDV-A75/17相同的第二個(gè)起始密碼子，因?yàn)镃DV-FOX-TA這一區(qū)域的核苷酸與CDV-A75/17是完全保守的。C

4、DV各毒株的F基因存在較大的差異，信號(hào)肽區(qū)域變異很大，但是F0蛋白裂解點(diǎn)(RRQRR)、13個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)潛在的天冬氨酰糖基化位點(diǎn)和2個(gè)疏水區(qū)都高度保守。 3.CDV-FOX-TAN基因含有1個(gè)ORF，全長(zhǎng)1572bp，共編碼523個(gè)氨基酸，編碼的氨基酸序列可以分為三個(gè)區(qū)：N端可變區(qū)、C端可變區(qū)和中間高度保守區(qū)。CDV-FOX-TAN基因與CDV-Onderstepoort、CDV-Convac的N基因的同源性分別為96.