豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)主要引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE),TGE是一種高度接觸性的腸道傳染病,主要是引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水以及消瘦等,并且能夠造成仔豬死亡,尤其對兩周齡以內(nèi)的仔豬造成的危害最大,死亡率能夠達到100％。該病主要爆發(fā)于冬季以及早春時節(jié),傳播迅速,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失

2、。目前實驗室對TGEV病原主要是通過常規(guī)RT-PCR來檢測,而常規(guī)的RT-PCR相對于熒光定量RT-PCR,靈敏性較低。常規(guī)RT-PCR適用于發(fā)病嚴重的仔豬,而對于潛伏感染或者感染早期,則需要靈敏性更高的檢測方法來實現(xiàn),從而在豬感染早期即可采取有效的防控以減少TGE的爆發(fā)帶來的損失。
　　 本實驗主要是為臨床檢測建立靈敏性更高的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。通過對TGEV高度保守的N蛋白基因序列和GenBank上已經(jīng)發(fā)布

3、的序列進行比較,選擇突變小的區(qū)域,設(shè)計引物和探針,并通過克隆制備出陽性標準品,通過得到的標準曲線得知,反應(yīng)模版的濃度與熒光定量的CT值具有很好的線性關(guān)系,其直線方程為y=-3.15181gx+51.613,相關(guān)系數(shù)達到0.997,且該方法具有很高的靈敏度和很好的特異性。它能夠檢測出最低的TGEV的DNA含量為1.445×10-6 ng/μL。同時通過與常規(guī)RT-PCR方法進行比較,得到該方法的敏感性比常規(guī)RT-PCR方法要高出約100倍

4、。由于檢測方法敏感性比常規(guī)RT-PCR方法更高,因此對豬群的早期感染更能做出準確的判斷,對預(yù)防和防治TGE的爆發(fā)能夠起到重要作用。
　　 同時,針對TGE的防治,目前臨床上主要采取疫苗免疫來進行,其他藥物等只能起到一個提高機體的抵抗力以及防止繼發(fā)感染等的輔助作用。因此疫苗接種免疫對TGE的預(yù)防和治療顯得尤為重要。
　　 本實驗室以沙門氏菌為載體,構(gòu)建了一個豬傳染性胃腸炎的基因工程活疫苗,然后進行動物免疫保護性試驗。選取T

5、GEV陰性的42頭豬,分成4組:非免疫組、空質(zhì)粒免疫組,基因工程疫苗組和正常對照組。通過免疫后再人工攻毒,進行免疫保護性試驗。臨床癥狀表明,非免疫組以及空載體攻毒組表現(xiàn)出嚴重的TGE癥狀,而基因工程疫苗組臨床癥狀表現(xiàn)不明顯。通過HE然后能夠發(fā)現(xiàn),非免疫組以及空質(zhì)粒免疫組小腸出現(xiàn)嚴重病變,腸絨毛壞死,脫落等嚴重,同時應(yīng)用免疫組化和熒光定量RT-PCR方法檢測,發(fā)現(xiàn)病毒主要集聚在小腸,這就證明了病豬在感染TGEV后,主要出現(xiàn)腹瀉、脫水及消瘦