豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬博卡病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病。感染后，主要引起豬的嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水，各種年齡的豬均易感染。豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis

2、virus of swine，TGEV)引起的一種導(dǎo)致豬嘔吐、水樣腹瀉和脫水等主要癥狀的急性、高度接觸性傳染病。豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)是2009年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)小病毒，屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬。目前已經(jīng)證實(shí)，多種博卡病毒都能夠感染并且導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉。目前的數(shù)據(jù)表明，PBoV與目前豬的腹瀉疫情具有一定的相關(guān)性，但是不能證明PBoV是原發(fā)性病原或者對(duì)其他豬腹瀉病毒的爆發(fā)起到協(xié)同作用。由于TGEV、P

3、EDV這兩種病毒臨床上呈現(xiàn)出相似的癥狀，經(jīng)常會(huì)發(fā)生混合感染，而PBoV又與腹瀉疫情相關(guān)。因此，為了評(píng)估PBoV對(duì)TGEV以及PEDV的流行是否會(huì)有加劇的現(xiàn)象，所以需要對(duì)這三種病毒進(jìn)行鑒別診斷。
　　由于臨床診斷非常困難，而以往的血清學(xué)診斷準(zhǔn)確率低，病毒分離診斷方法雖然準(zhǔn)確率高，但操作較為復(fù)雜。PCR方法較傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，現(xiàn)今己經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的鑒別診斷。而多重PCR方法可在同一PCR體系中加入多對(duì)

4、引物，可同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。既具有傳統(tǒng)PCR方法的優(yōu)點(diǎn)，又可對(duì)同一樣品同時(shí)檢測(cè)多種病原，可以達(dá)到同步診斷的目的，并且縮短檢測(cè)時(shí)間，減少試劑消耗。為此，本文進(jìn)行了PEDV、TGEV和PBoV多重PCR檢測(cè)方法的研究。根據(jù)PEDV、TGEV和PBoV的保守基因M、S、NP1分別設(shè)計(jì)合成了3對(duì)特異性引物，成功擴(kuò)增了這三種基因，在國(guó)內(nèi)首次建立了同時(shí)快速鑒別診斷這3種病毒的PCR方法。經(jīng)過(guò)敏感性以及特異性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)方法對(duì)PEDV的最

5、高敏感度為20pg，TGEV的最高敏感度為35pg，PBoV的最高敏感度為10pg;并通過(guò)對(duì)其他幾種病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)本方法特異性良好，可以應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。
　　在此基礎(chǔ)上，將多重PCR方法與單一PCR方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，對(duì)2012年送檢的120份樣品進(jìn)行了檢測(cè)（其中90份為腹瀉豬糞便樣品，30份為健康豬糞便樣品）。在90份發(fā)病豬樣品中，PEDV、TGEV和PBoV的陽(yáng)性率分別為23.33％、1.11％和22.22％,