間接ELISA檢測豬傳染性胃腸炎與豬呼吸道冠狀病毒抗體的方法建立.pdf

1、本研究對TGEVSBC蛋白（在PRCV中缺失）和TGEVN蛋白(TGEV與PRCV共有)進行了原核表達，建立了以重組SBC和N蛋白為抗原的檢測TGEV與PRCV抗體的間接ELISA方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.TGEV重組SBC和N蛋白的表達與純化
　　 將構(gòu)建保存的重組表達菌pET32a-SBCBL21(DE3)和pET32a-NBL21(DE3)進行誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，誘導的pET32

2、a-SBC和pET32a-N分別獲得了3.8kDa和67kDa大小的濃縮蛋白帶。對重組SBC和N蛋白進行純化。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，重組的TGEVSBC和N蛋白與抗TGEV的豬血清發(fā)生特異性反應，表明其具有抗原活性。
　　 2.TGEV重組SBC和N蛋白作為包被抗原，建立檢測TGEV與PRCV抗體的間接ELISA方法
　　 分別以TGEV重組SBC和N蛋白作為包被抗原篩選確定了間接ELISA檢測TGEV與PRCV抗體的

3、最佳反應條件：重組SBC和N蛋白最佳抗原包被濃度分別為1.4μg/ml（稀釋160倍）和1.1μg/ml（稀釋320倍）；血清的稀釋度分別為320和640倍；PBST稀釋液中蛋白穩(wěn)定劑為5％小牛血清；封閉液分別為2％脫脂牛奶和5％小牛血清，于37℃封閉90min；酶標二抗反應條件分別為4800倍和9600倍稀釋，37℃孵育,30min；SBC和N蛋白包被孔的陽性臨界值分別為0.1417和0.1958。
　　 特異性結(jié)果顯示，SB

4、C和N蛋白包被孔與豬流行性腹瀉病毒、豬大腸桿菌病、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的陽性血清、PBS均不發(fā)生交叉反應。SBC蛋白包被孔不與PRCV陽性血清發(fā)生交叉反應，而N蛋白包被孔與PRCV陽性血清發(fā)生交叉反應。ELISA的重復性結(jié)果顯示：SBC蛋白包被孔的批內(nèi)與批間檢測結(jié)果的變異系數(shù)低于10％，而N蛋白包被孔的批內(nèi)與批間平均變異系數(shù)分別低于10％及11％。
　　 3.TGEV與PRC