豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的豬腸道疾病，以引起嚴(yán)重的腸炎和腹瀉為主要特征，哺乳仔豬的病死率高達(dá)90％，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立了基于TaqMan探針的PEDV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，并應(yīng)用此方法對一些臨床和人工發(fā)病的樣品進(jìn)行了檢測。
　　 1.PEDV實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2、檢測方法的建立
　　 根據(jù)GenBank中豬流行性腹瀉病毒N基因序列設(shè)計(jì)一對引物，用PCR方法從PEDV病料中擴(kuò)增出N1基因（449bp）。將此基因片段克隆入pMD18-T載體，經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定，篩選出重組質(zhì)粒pMD18-T/N1。根據(jù)PEDVN基因序列中的保守片段設(shè)計(jì)一對特異引物和TaqMan探針。以質(zhì)粒pMD18-T/N1為模板，通過條件優(yōu)化，以定量的10倍系列稀釋的質(zhì)粒pMD18-T/N1為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量P

3、CR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了PEDV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明該方法檢測靈敏度可達(dá)1.0×10′拷貝/μL。對起始濃度為1.0×109、1.0×108、1.0×107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)際測得值（Ct）分別為7.03、9.93、13.55、；變異系數(shù)分別為0.9％、1.1％、0.6％，均小于5％。說明此方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。對陽性模板的檢測結(jié)果表明該方法的檢測靈敏度高于常規(guī)PCR。
　　 2.PEDV