牛冠狀病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬2a亞群，是引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病學(xué)調(diào)查表明，牛冠狀病毒在牛場中普遍存在，主要通過消化道和呼吸道傳播，感染的牛長期帶毒并在一定時期內(nèi)持續(xù)排毒，易造成牛群的大范圍感染。因此，對帶毒牛的及時檢出和牛場環(huán)境監(jiān)測就顯得尤為重要。目前國內(nèi)外尚無針對BCoV感染治療的特效藥物，奶業(yè)發(fā)達國家應(yīng)用滅活疫苗或減毒疫苗預(yù)防本病，而我國尚

2、無相關(guān)商品化疫苗。因此，亟需建立該病毒快速敏感的檢測方法，并對我國部分地區(qū)奶牛場的BCoV流行情況進行調(diào)查，及早發(fā)現(xiàn)BCoV感染的牛，掌握流行病學(xué)數(shù)據(jù)，以便及時采取更有效的針對性措施進行防控，以減少該病毒對養(yǎng)牛業(yè)造成的經(jīng)濟損失。
　　本研究根據(jù)GenBank收錄的牛冠狀病毒N基因序列，設(shè)計合成了1對擴增N基因部分片段的特異性引物，以BCoV病毒的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化回收后送華大基因測序，將測序正確后的N基

3、因片段連接到pEASY-T3載體上，經(jīng)酶切鑒定、測序驗證獲得了重組質(zhì)粒pEASY-T3-N。以得到的重組質(zhì)粒pEASY-T3-N為陽性標準品，進行一系列稀釋，選取6個梯度稀釋的標準品作為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，建立標準曲線和回歸方程。然后運用常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR方法，對2013～2014年本實驗室采集的5個規(guī)模化奶牛場的212份臨床樣本進行病原學(xué)檢測。最后設(shè)計合成了1對用于擴增N基因全長的特異性引物，將PCR擴增后產(chǎn)物送測

4、序鑒定，應(yīng)用DNAstar生物學(xué)軟件將測得的N基因全長序列與GenBank中的序列進行系統(tǒng)發(fā)生分析。
　　序列測定表明，我們克隆獲得的100bp大小的片段正確，并且成功獲得了重組質(zhì)粒pEASY-T3-N陽性標準品。在建立的牛冠狀病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法中，一個反應(yīng)體系中模板最低檢測限為7.8 copies/μL，比普通RT-PCR更加靈敏；熔解曲線只出現(xiàn)特異性的單個峰，而沒有明顯的引物二聚體或者非特異性

5、擴增的峰出現(xiàn)，證明該方法具有良好的特異性。同時與牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BE

6、FV）和牛副流感病毒3型（bovine parainfluenzavirus type3，BPIV-3）均無交叉反應(yīng)；批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)均低于1.5％。因此，該方法敏感性高，特異性強，重復(fù)性好，為牛冠狀病毒的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)保障。
　　通過對臨床樣本進行PCR檢測發(fā)現(xiàn)：在107份鼻拭子樣本中，BCoV感染陽性率為5.61%，同時檢測到BCoV分別與BVDV、IBRV、BPIV3混合感染陽性率依次為4.60%、4