牛瑟氏泰勒蟲熒光定量PCR方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）是經(jīng)過蜱傳播的泰勒科（Theileriidae）、泰勒屬（Theileria）的血液原蟲。臨床上感染瑟氏泰勒蟲的牛會(huì)出現(xiàn)慢性貧血和高熱、黃疸，甚至死亡。當(dāng)前，牛瑟氏泰勒蟲病在全世界的各個(gè)地區(qū)分布較為廣泛。隨著全球經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來的日趨密集和養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，各國之間牛類產(chǎn)品的交易量劇增，不同大洲或地區(qū)的國家相繼報(bào)道了牛瑟氏泰勒蟲病。在這種嚴(yán)峻的情況下，對牛瑟氏泰勒蟲病的監(jiān)控和防治提出了更

2、新、更高的要求。
　　實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real-time Fluorescent Quantitive Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR）PCR反應(yīng)體系中加熒光集團(tuán)，通過受體發(fā)色團(tuán)偶極-偶極的作用使能量由供體轉(zhuǎn)移至受體，受體發(fā)射的熒光信號強(qiáng)度與DNA的產(chǎn)量成正比，因此通過檢測熒光信號強(qiáng)度從而去測定產(chǎn)物的量，進(jìn)而推出靶序列的初始量。該技術(shù)自1996年產(chǎn)生以來，經(jīng)過不斷地發(fā)展和完善，現(xiàn)在已經(jīng)非常成

3、熟并得到了廣泛的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的SYBR Green PCR方法可結(jié)合雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光，而TaqManPCR方法是利用探針使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出出熒光。
　　本試驗(yàn)根據(jù)牛瑟氏泰勒蟲P33基因設(shè)計(jì)2對特異性引物，首先對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了制備和鑒定。把鑒定正確的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋后測定濃度。然后用稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品建立SYBR Green PCR和TaqMan PCR方法。分別對兩種方法進(jìn)行引物濃度優(yōu)化、敏感性、特異性、

4、重復(fù)性等不同方面的研究。SYBR Green PCR方法中，引物最適濃度為0.4μmol/L；檢測的線性范圍為2.26×108拷貝/μL-2.26×100拷貝/μL；通過熔解曲線分析表明該方法具有良好的特異性；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)、穩(wěn)定性系數(shù)的CV值都小于5％，表明該方法重復(fù)性良好。而TaqMan PCR方法中，引物最適濃度為0.4μmol/L，探針濃度0.3μmol/L；檢測的線性范圍為2.26×108拷貝/μL-2.26×10

5、0拷貝/μL；通過熔解曲線分析表明該方法具有良好的特異性；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)、穩(wěn)定性系數(shù)的CV值都小于5%，表明該方法重復(fù)性較好。
　　用本試驗(yàn)建立的TsP1-SYBR Green PCR和TsP1-TaqMan PCR與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示三種方法均有較好的特異性，而兩種熒光定量 PCR方法顯示出較高的靈敏度，比常規(guī)PCR方法靈敏度提高了10000倍。對采自琿春市和松原市79份臨床樣本的檢測結(jié)果顯示，常規(guī) P

6、CR方法檢出率為36.71%、TsP1-SYBR Green PCR檢出率為46.84%、TsP1-TaqMan PCR檢出率為46.84%。TsP1-SYBR Green PCR和TsP1-TaqMan PCR符合率為100%。
　　本試驗(yàn)建立牛瑟氏泰勒蟲病的SYBR Green PCR方法和TaqMan PCR方法。該方法不但克服了其它診斷方法靈敏度低、易交叉污染、特異性差、假陽性率高、檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)，能更快速且敏感、高通量