蜜蜂白堊病PCR及熒光實(shí)時(shí)定量PCR診斷方法的建立.pdf

1、蜜蜂白堊病(bee chalkbrood disease)是一種由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)寄生而引起蜜蜂幼蟲死亡的真菌性傳染病。蜜蜂球囊菌的孢子的抗逆性極強(qiáng)，其在花粉中的存活期為1年，而在干燥條件下能夠存活15年。該病傳播的媒介廣泛，污染的飼料與蜂具等都是傳播的主要媒介。群內(nèi)傳播主要是通過(guò)內(nèi)勤蜂的飼喂活動(dòng)，將花粉中的孢子傳染給健康幼蟲而染病，此外，菌絲體也能直接侵染幼蟲。白堊病在我國(guó)及世界各地都有發(fā)生，而且在我國(guó)一

2、些地區(qū)的蜂群中蜜蜂傳染病近年呈爆發(fā)流行，是養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的大敵，嚴(yán)重影響著世界各國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展及蜂蜜的產(chǎn)量和質(zhì)量。白堊病發(fā)病后很難控制，染上白堊病的蜂群重則全群覆沒(méi)，輕則群勢(shì)漸弱。同時(shí)，由于病原體對(duì)蜂蜜的污染和發(fā)病后的用藥不當(dāng)造成的獸藥殘留超標(biāo)都嚴(yán)重地影響了蜂蜜的質(zhì)量，近年來(lái)成為困擾蜂蜜世界貿(mào)易最重要因素。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)白堊病的檢測(cè)和防治，都沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范。因此，白堊病的及時(shí)準(zhǔn)確診斷對(duì)于該病的防治極為重要，只有及時(shí)診斷、合理用藥才能有效防治白

3、堊病和盡量避免用藥在蜂蜜中造成殘留。 隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)诶肞CR技術(shù)進(jìn)行定量研究方面進(jìn)行了一系列有意義的探索?，F(xiàn)在PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在人和動(dòng)物傳染病診斷方面已廣泛應(yīng)用，在蜂病的診斷研究方面在國(guó)外也已有一些研究報(bào)道，但在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有這方面的研究報(bào)道。PCR檢測(cè)方法具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于快速診斷蜜蜂傳染病，尤其對(duì)于病毒病及多種病原引起的混合感染的鑒別診斷更為有效。蜂病的發(fā)生不僅影響蜂蜜的產(chǎn)量，而

4、且病原又會(huì)進(jìn)一步污染蜂蜜，從而嚴(yán)重影響蜂蜜質(zhì)量，影響出口。PCR方法還可直接用于蜂產(chǎn)品中這些病原污染的快速檢測(cè)。通過(guò)研制PCR及熒光定量PCR方法可對(duì)蜜蜂傳染病作出快速準(zhǔn)確診斷，正確指導(dǎo)用藥，做到早診斷，早治療，避免盲目用藥造成獸藥殘留超標(biāo)。 本研究根據(jù)Genebank網(wǎng)站公布的蜜蜂球囊菌ITS1，5.8srRNA，ITS2(internaltranscribed spacer 1，5.8S ribosomal RNA gene

5、，and interaal transcribed spacer 2.)序列，利用DNAstar軟件對(duì)其進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物primerA<,1>、primerA<,2>，可特異性的擴(kuò)增蜜蜂球囊菌ITS1，5.8srRNA,ITS2序列上大小為471bp的片段。本研究通過(guò)系列試驗(yàn)優(yōu)化建立了PCR最佳反應(yīng)條件和最佳反應(yīng)體系，并通過(guò)敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)表明所建立的PCR方法具有良好的敏感

6、性、特異性和穩(wěn)定性。建立的PCR方法可以檢測(cè)到7CFU/ml的病原樣品，整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程5個(gè)小時(shí)，較常規(guī)臨床診斷或ELISA診斷方法提高了敏感性且縮短了診斷時(shí)間，做到能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出蜜蜂白堊病病原菌。 建立了檢測(cè)白堊病原蜜蜂球囊菌DNA的熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法。根據(jù)已發(fā)表的蜜蜂球囊菌ITS1，5.8srRNA，ITS2序列，利用DNAstar軟件對(duì)其進(jìn)行同源性比較，選取保守序列U68313作為模板，應(yīng)用DNAman軟件設(shè)計(jì)出

7、一對(duì)引物primerA<,3>、primerA<,4>及Taqman探針probeA。核酸探針probeA兩端用熒光染料修飾，5’端報(bào)告熒光為-FAM(6-Carboxyfluoreseiein)，在518nm處有最大的吸光值；3’端淬滅熒光為-TAMRA(6-Carboxytetramethylrhodamine)，在582nm處有最大吸光值。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，本試驗(yàn)應(yīng)用的引物、探針可擴(kuò)增1ng的蜜蜂球囊菌DNA樣品，檢測(cè)蜜蜂幼蟲芽孢桿菌

8、、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂敗血桿菌呈陰性，說(shuō)明本研究建立的熒光實(shí)時(shí)定量。PCR高度敏感、特異性；本試驗(yàn)所用的儀器為ABI 7000，可同時(shí)檢測(cè)96份樣品，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)熒光強(qiáng)度的改變情況，又因不用電泳，大大減少PCR產(chǎn)物污染，因此本試驗(yàn)建立的方法即具有高通量性，可用于大量樣品的長(zhǎng)期檢測(cè)而不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染，提高了方法的特異性，還具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，一般在4小時(shí)內(nèi)作出檢測(cè)結(jié)果。如果發(fā)生假陽(yáng)性，可很快用備份樣品實(shí)行快速檢測(cè)進(jìn)行糾正，作出比