蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的分離鑒定及PCR診斷方法的建立.pdf

1、蜜蜂美洲幼蟲腐臭病（American foulbrood，AFB），簡稱美幼病，是目前主要侵害蜜蜂幼蟲生長的細菌性病害之一。美幼病的病原體是幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus Larvae），革蘭氏染色呈陽性。該菌的芽孢具有7層結(jié)構(gòu)包圍，而一般細菌的芽孢具有4~5層結(jié)構(gòu)包圍。這種特殊的結(jié)構(gòu)使幼蟲芽孢桿菌的芽孢生命力特別頑強，對熱刺激和化學(xué)消毒劑等都具有很強的抵抗力，在高溫、干燥等惡劣環(huán)境下仍然可以保持很強的感染性，能存活35年之久

2、。正是因為幼蟲芽孢桿菌具有這種特殊結(jié)構(gòu)的芽孢可以引起美洲幼蟲腐臭病，而并非是其營養(yǎng)體的作用。在蜂群內(nèi)傳播方式包括水平傳播和垂直傳播，而在群間主要是通過垂直傳播的方式。也因為傳播方式的特殊性使其成為影響蜜蜂幼蟲生長的主要疾病。該病多發(fā)生于夏、秋兩季，輕者影響蜂群的繁殖和采集力，重者造成全群或全場蜂群覆滅。目前國內(nèi)外關(guān)于美幼病病原體檢測鑒定的報道還比較少，且大多集中于研究細菌分離、菌落形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、生化試驗等檢測方法。然而，由于芽孢

3、在病蟲或蜂蜜樣品中的含量比較少，且有很多其他相近種類的細菌，使得分離鑒定的難度有所增加。但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR檢測方法因其診斷快速、敏感性較高、特異性較強等特點，可用于快速應(yīng)用于美洲幼蟲腐臭病的診斷，尤其可針對蜂病的混合感染和蜂產(chǎn)品的質(zhì)量檢測更為有效。
　　近幾年來，養(yǎng)蜂業(yè)已成為吉林省延邊朝鮮族自治州的特色牧業(yè)，隨著蜜蜂養(yǎng)殖密度加大，蜜蜂各種疾病的發(fā)生也伴隨而來，影響著養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展。美洲幼蟲腐臭病如今已成為嚴重威脅延邊養(yǎng)蜂

4、業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，因此，分離幼蟲芽孢桿菌本地株、建立患病蜜蜂和蜂產(chǎn)品檢測方法的研究是十分必要的。
　　本試驗為了分離幼蟲芽孢桿菌延邊株，利用疑似患美幼病的病蟲通過改良胡蘿卜酵母瓊脂培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)，成功分離出特異性菌落；并利用革蘭氏染色、孔雀石綠染色等方法鏡檢觀察、H2O2試驗、牛乳試驗等細菌的生化特性進行生化鑒定，以及 PCR分子生物學(xué)方法進行初步鑒定。結(jié)果顯示，革蘭氏染色鏡檢可見清晰的革蘭氏陽性桿形菌體?？兹甘G染色鏡檢可

5、見菌體為紅色，芽孢為綠色。菌株在H2O2試驗反應(yīng)中沒有氣泡產(chǎn)生，牛乳試驗結(jié)果表明加入菌體的新鮮牛奶出現(xiàn)凝結(jié)沉淀稍后又消失。PCR擴增顯示該菌在1.0％瓊脂糖凝膠電泳1474 bp左右有清晰條帶，以上結(jié)果初步證明所分離的菌體為幼蟲芽孢桿菌。
　　根據(jù)分離的幼蟲芽孢桿菌測序結(jié)果以及 GenBank發(fā)表的幼蟲芽孢桿菌16S rRNA基因保守區(qū)（AB073204）設(shè)計合成一對特異性引物 AFBU和 AFBL，建立本地幼蟲芽孢桿菌的PCR檢

6、測方法。結(jié)果表明，該方法可特異性擴增幼蟲芽孢桿菌16S rRNA序列上大小為1353bp的片段，對蜜蜂敗血桿菌、蜜蜂球囊菌、蜂房蜜蜂球菌的擴增結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性；對倍比稀釋的芽孢桿菌進行檢測，其敏感性可達45CFU/mL的幼蟲芽孢桿菌。將一定量的幼蟲芽孢桿菌增添到蜂蜜、蜂膠和蜂王漿等蜂產(chǎn)品中進行檢測結(jié)果說明，建立的PCR檢測方法具有快速、準確、敏感、特異等優(yōu)點，完全適用于疑似患病蜜蜂和蜂產(chǎn)品的檢測。應(yīng)用所建立的PCR檢測方法