牛源化膿隱秘桿菌的分離鑒定及其PCR檢測方法的建立.pdf

1、化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogene)是一種形態(tài)呈桿狀的革蘭氏陽性菌，在動物機體免疫力低下時，能夠條件性的引起多種動物的化膿性感染，特別是黏膜組織感染；繼而繼發(fā)多種疾病，如奶牛乳房炎、牛子宮炎、腎膿腫感染、肝膿腫、火雞骨髓炎、母豬子宮內(nèi)膜炎、仔豬關(guān)節(jié)炎和豬肺炎、以及多種動物急性呼吸道感染癥等。畜禽條件性感染化膿隱秘桿菌造成的生產(chǎn)性能下降、機體抵抗力減弱等對養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展造成一定危害。
　　 本文以致

2、規(guī)?；鰻倥Ｉ虾粑兰毙愿腥镜牟≡瓩z測為出發(fā)點，從病死犢牛肺臟等呼吸器官組織中分離出2株細菌。對分離菌進行常規(guī)細菌學(xué)鑒定(形態(tài)特征、染色特性、培養(yǎng)特性及生化特性等)和Biolog自動快速微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，結(jié)合16SrRNA分析確定分離菌為化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)。小鼠致病性試驗顯示純培養(yǎng)物對小鼠致死率較高，藥敏試驗表明分離菌僅對少數(shù)種類抗生素如頭孢唑啉、氧氟沙星等敏感，為臨床用藥提供了參考。<

3、br>　　 為快速診斷化膿隱秘桿菌感染，建立了檢測溶血素(PLO)基因的快速PCR方法，敏感性試驗顯示最低檢出菌數(shù)為9.2×103CFU/mL，特異性試驗表明與其他細菌如布魯氏菌、大腸桿菌等無交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗顯示此方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。在臨床檢查中，PCR檢測與傳統(tǒng)生化鑒定一致。
　　 為研究化膿隱秘桿菌的致病力，本課題相繼克隆了該菌的3個毒力因子溶血素(pyolysin，PLO)、膠原結(jié)合蛋白(Collagen-

4、Binding Protein，cbpA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidases，nanH)的基因，參考GenBank已經(jīng)發(fā)表的基因序列，設(shè)計了7對引物，通過PCR分別克隆化膿隱秘桿菌的plo、cbpA、nanH基因，通過序列測定，研究了其與參考毒株的同源性。結(jié)果表明：克隆的plo基因核苷酸序列與GenBank中收錄的化膿隱秘桿菌的基因的同源性在98％以上，克隆的cbpA、nanH基因核苷酸序列與GenBank中收錄的化膿隱秘桿菌的

5、基因的同源性在85%以上，種系進化樹分析結(jié)果進一步表明了其與化膿隱秘桿菌屬進化結(jié)果一致。該菌3個毒力因子的克隆，為在基因水平上探討細菌毒力因子與細菌致病力的關(guān)系提供了物質(zhì)材料，為分離菌致病性相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究成功分離和鑒定了2株化膿隱秘桿菌，數(shù)次藥敏試驗為臨床用藥提供了依據(jù)；分離菌主要毒力因子的克隆和序列分析，為研究毒力因子與細菌致病力的關(guān)系提供了基礎(chǔ)材料。并在研究毒力因子溶血素的基礎(chǔ)上，建立了一種特異、敏感的P