禽波氏桿菌免疫PCR檢測方法的建立及其亞單位疫苗的研制.pdf

1、禽波氏桿菌（Bordetella avium，B.avium）最早于1967年分離自火雞，該菌引起的禽波氏桿菌病是一種高度接觸傳染性疫病，具有高度上呼吸道接觸傳染性，1周齡內的雛禽最易感，主要引起禽類的鼻炎、眼炎等呼吸道癥狀，造成種雞場孵化率降低、死胎率高和弱雛增加。在中國，朱瑞良教授在1991年首次報道了雞波氏桿菌病，隨后從病雞眼中分離得到了禽波氏桿菌（朱瑞良，1994）。禽波氏桿菌可垂直傳播，又可水平傳播。禽波氏桿菌感染的同時，常常

2、繼發(fā)或并發(fā)感染免疫抑制病毒（ALV、REV、CIAV等）、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和熒光假單胞菌，使禽波氏桿菌病的危害不斷放大。近幾年，在全國不同地區(qū)經流行病學調查發(fā)現(xiàn)禽波氏桿菌的感染率在10％到50％之間，給我國的養(yǎng)禽業(yè)已經造成了巨大的經濟損失，對該病做出及時快速的診斷及防控十分必要，因此，禽波氏桿菌快速靈敏的診斷方法的建立和疫苗的制備在預防禽波氏桿菌感染和及時診斷治療方面顯得尤為重要。本研究由以下五個部分組成:
　　 1.禽

3、波氏桿菌外膜蛋白單克隆抗體的抗原識別位點分析
　　 對本試驗室凍存的3株雜交瘤細胞株(3G10、4A3和4E8)進行復蘇，經過3次有限稀釋法克隆后，制備腹水。通過間接ELISA試驗證明，凍存后復蘇的3株雜交瘤細胞株均能穩(wěn)定的分泌抗體，經檢測得出產生的腹水效價較高，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的單抗效價為1∶320～1∶640，腹水中單抗效價為1∶6400～1∶12800。測定單克隆抗體的飽和工作濃度，繪制單克隆抗體的飽和曲線圖，根據(jù)曲線得

4、出單克隆抗體3G10、4A3、4E8的飽和工作濃度分別為1∶80、1∶80和1∶160。然后用ELISA相加試驗分析單克隆抗體的抗原結合位點。通過計算相加指數(shù)AI來分析抗原位點的結合情況，本試驗復蘇的3株雜交瘤細胞產生的單克隆抗體，進行相加ELISA試驗，3G10、4A3和4E8的相加指數(shù)均小于50％，說明3株單克隆抗體識別的抗原位點可能相同或者比較接近。經westem-blot試驗進行鑒定，3株單克隆抗體均特異性識別禽波氏桿菌外膜蛋白

5、58KD上的抗原表位。本試驗通過對單克隆抗體識別抗原位點的分析，為特異性診斷試劑的研制奠定了基礎。
　　 2.免疫PCR技術檢測禽波氏桿菌方法的建立
　　 選擇抗體效價最高的單克隆抗體4E8株作為包被抗體，包被在酶標板上，使用禽波氏桿菌菌體抗原免疫家兔制備多克隆抗體，以多克隆抗體作為檢測抗體。以pUC19質粒為模板，用生物素標記的引物，進行PCR擴增，得到生物素標記的DNA報告分子。使用鏈霉親和素作為連接分子，將生物素標

6、記的報告DNA連接到生物素標記的羊抗兔IgG分子上，利用PCR擴增報告DNA分子，經過瓊脂糖凝膠電泳后觀察出現(xiàn)特異性的擴增條帶的情況，如果出現(xiàn)特異性的擴增條帶，那表明待檢樣品中含有禽波氏桿菌。
　　 試驗中對生物素標記的報告DNA和鏈霉親和素的工作濃度進行了測定，得出生物素標記的報告DNA最適工作濃度為10ng/mL，鏈霉親和素最適工作濃度為10ng/mL。對傳統(tǒng)的間接ELISA方法與建立的免疫PCR的靈敏度進行比較，間接ELI

7、SA方法檢測出禽波氏桿菌菌液的最低濃度為103CFU/mL，免疫PCR法的最低檢測濃度為1 CFU/mL。因此，本試驗建立的免疫PCR方法的靈敏度比間接ELISA方法提高了近103倍。然后利用禽波氏桿菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、雞奇異變形桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和綠膿桿菌對建立的免疫PCR方法進行特異性檢測，結果說明該方法具有高度特異性。
　　 3.免疫PCR檢測禽波氏桿菌的應用研究
　　 對試驗室保存的1991年至今

8、分離到的22株禽波氏桿菌進行免疫PCR的檢測，所有菌株均擴增出了特異性條帶，說明該方法可以用于對禽波氏桿菌的檢測。
　　 在對患病雞場中采集病料的檢測中，常規(guī)的細菌分離培養(yǎng)和鑒定，確切的鑒定某種細菌的感染最少需要3-4d的時間，費時費力。免疫PCR方法能夠特異性的檢測出禽波氏桿菌的感染，而且僅需要20h左右，節(jié)省了時間。
　　 對患病雞場采集的130份血清的檢測中，使用了平板凝集試驗、間接ELISA試驗和免疫PCR試驗三

9、種方法，并對三種試驗進行比較。平板凝集試驗結果有82份血清樣本為陽性，25份可疑，陽性率為63.1％;間接ELISA試驗結果有96份血清樣本為陽性，陽性率為73.8％;而免疫PCR方法檢測結果顯示，經其它兩種方法檢測的陽性血清全部顯示陽性結果，從判斷為可疑或是陰性的檢查樣品中也檢測出了陽性樣品，陽性率為80.7％。三種檢驗方法相比，免疫PCR比平板凝集試驗、間接ELISA試驗更加敏感、檢出率更高。
　　 在對禽波氏桿菌感染雛雞后

10、在雞體內定植規(guī)律的檢測中，感染后1d，能夠在氣管和肺臟中經PCR擴增出特異性條帶，并且一直持續(xù)存在至第6d采樣結束;感染4d后，在心臟、肝臟和脾臟中擴增出特異性條帶;感染后6d，在腎臟中擴增出特異性條帶。檢測結果優(yōu)于細菌涂板培養(yǎng)，檢出時間提前。
　　 4.禽波氏桿菌分離株抗原性與免疫原性差異分析
　　 首先將復壯的22株禽波氏桿菌免疫動物制備高免血清，利用凝集試驗測定各菌株血清效價的高低，結果顯示了各菌株抗原性的大小。根

11、據(jù)凝集試驗的結果，按照血清型和基因型的不同，選擇出8株抗原性較高的禽波氏桿菌來進行交叉凝集試驗和免疫瓊脂擴散試驗，分析菌株之間是否存在共同的抗原成分。然后進行免疫保護試驗，分析各菌株間的交叉免疫保護情況。
　　 凝集試驗結果顯示，22株分離株的血清抗體效價在1∶320～1280之間，均能刺激機體產生高效價的抗體，抗原性較好。交叉凝集試驗和免疫瓊脂擴散試驗結果顯示，選擇的8株代表株之間存在共同的抗原成分，但是交叉凝集抗體效價均比較

12、低。
　　 免疫保護試驗結果說明免疫菌苗對相應菌株的攻擊具有較高的免疫保護率，對于同實驗組內其它菌株的攻擊，存在交叉免疫保護，但是保護率較低。其中Ba15株制備的疫苗對于同型菌株或者異型菌株的攻擊，均表現(xiàn)出較高的免疫保護率，Ba11株和Ba8株次之。
　　 5.禽波氏桿菌亞單位疫苗的研制及免疫效果的研究
　　 本試驗利用提取的禽波氏桿菌外膜蛋白作為免疫原，選擇松花粉多糖、蜂膠和白油作為免疫佐劑來進行比較。將松花粉

13、多糖設計成10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL等3個劑量，把等量的禽波氏桿菌外膜蛋白與不同劑量的松花粉多糖、蜂膠、白油分別組合，制備不同免疫佐劑的禽波氏桿菌亞單位疫苗。將制備的疫苗進行無菌檢驗和安全性檢驗，結果證明，本試驗制備的不同免疫佐劑的禽波氏桿菌亞單位疫苗無菌性和安全性良好。
　　 將制備的疫苗免疫雛雞，檢測免疫后不同時間雛雞的體液免疫和細胞免疫的各項指標。結果表明，免疫后，各組疫苗均能刺激機體產生不同程度的抗體

14、水平，并且能夠持續(xù)存在。而對于各項細胞免疫指標的測定說明，制備的亞單位疫苗能夠提高免疫動物的細胞免疫水平。在對各種佐劑的比較中，試驗結果證明Ⅲ組（40mg/ml松花粉多糖）各項指標顯著高于其他各組(P＜0.05)，Ⅳ組（蜂膠佐劑）指標高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組，但差異不顯著。免疫保護試驗結果顯示Ⅲ組（含40mg/ml松花粉多糖）保護率最高，Ⅳ組（蜂膠佐劑）保護率較好，優(yōu)于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組。不同佐劑組的免疫指標與免疫保護試驗的保護率呈平行關系，說明40

15、mg/ml松花粉多糖可以作為禽波氏桿菌亞單位疫苗的免疫佐劑，與禽波氏桿菌外膜蛋白混合，用于預防禽波氏桿菌的感染。
　　 總之，本研究結果表明試驗室保存的三株禽波氏桿菌外膜蛋白的單克隆抗體均特異性識別禽波氏桿菌外膜蛋白58KD處的抗原位點，位置相同或者相鄰。用4E8株和禽波氏桿菌多克隆抗體建立了雙抗體夾心免疫PCR檢測方法，實驗證明該方法具有較高的靈敏度和特異性，在臨床應用上，該方法在檢測時間和檢出率方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢驗方法，能夠