基于E2蛋白的豬瘟病毒IFA檢測方法建立及亞單位疫苗的初步研制.pdf

1、豬瘟是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，在我國仍時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。C株是世界上應(yīng)用最為廣泛的減毒疫苗株。大量數(shù)據(jù)表明，C株疫苗免疫效力好、安全性高，對小豬、懷孕母豬甚至是處于免疫抑制的豬群均不造成病理損傷，但是這種類型的減毒活疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，很難和野毒感染豬產(chǎn)生的抗體區(qū)分開，這不利于控制豬瘟的流行與凈化。為了能區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和感染

2、動(dòng)物，DIVA疫苗是目前的研究熱點(diǎn)。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是豬瘟病毒毒力及宿主范圍的主要決定性因素，位于病毒粒子外表面，有跨膜區(qū)，是建立豬瘟病毒血清學(xué)檢測方法的主要抗原。因此，豬瘟病毒E2蛋白是開發(fā)豬瘟病毒新型疫苗及診斷試劑的重要蛋白分子。
　　本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了豬瘟病毒的E2蛋白，利用純化的E2蛋白制備了豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，進(jìn)一步利用制備的單克隆抗體建立了豬瘟病毒的間接免疫熒光檢測方法;另外，

3、利用純化的E2蛋白初步研制了豬瘟E2蛋白亞單位疫苗，免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，研制的亞單位疫苗免疫效果良好，為豬瘟標(biāo)記亞單位疫苗的開發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。
　　1.豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的表達(dá)
　　提取CSFV的基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用oligo6設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CSFV E2基因的主要抗原區(qū)域，連接克隆載體構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18T-CSFV-E2'，再克隆至pET28a原核表達(dá)載體，構(gòu)建E2基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-

4、CSFV-E2'。將去除跨膜域后E2基因2433bp～2672bp區(qū)間的序列進(jìn)行在線密碼子優(yōu)化，合成優(yōu)化后序列，與克隆載體pTOPO-Blunt Simple連接，將連接正確的克隆質(zhì)粒命名為pTOPO-Simple-E2。
　　利用BamHⅠ和SacⅠ分別雙酶切pTOPO-Simple-E2和pET28-CSFV-E2'，取目的條帶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑選克隆陽性菌測序，序列比對顯示，優(yōu)化后的部分E2基

5、因已經(jīng)替代成功，將替換后的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28-CSFV-E2。通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，成功表達(dá)出E2蛋白。用Ni-NTA層析法純化E2蛋白，經(jīng)檢測純化E2蛋白的濃度可達(dá)3.48mg/ml。以商品化E2蛋白單抗進(jìn)行Western blot分析顯示該蛋白具有良好的抗原性。
　　2.豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及IFA檢測方法建立
　　以純化的E2蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨

6、髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG4000進(jìn)行融合，篩選后獲得兩株能穩(wěn)定分泌抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B1和3B4。經(jīng)IFA檢測，2B1和3B4的腹水效價(jià)分別為1.0×105和1.0×104，且兩個(gè)單克隆抗體細(xì)胞株重鏈均為IgG1亞型，輕鏈均為k鏈。
　　利用制備的單克隆抗體作為一抗，商品化的FITC-羊抗鼠作為二抗，建立了CFSV的IFA檢測方法。熒光顯微鏡觀察，102TCID50/ml的CSFV、1∶100倍稀釋

7、2B1腹水單抗時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)黃綠色特異性熒光。特異性試驗(yàn)表明，建立的IFA檢測方法只與CSFV發(fā)生特異性反應(yīng)，與PCV2及BVDV不發(fā)生交叉反應(yīng)。
　　利用建立的IFA方法，檢測了三批豬瘟成品疫苗的抗原含量，每批次疫苗重復(fù)檢測三次。結(jié)果表明同一批次疫苗重復(fù)檢測，抗原含量差異最高為100.1TCID50/ml，抗原含量比較穩(wěn)定，驗(yàn)證了IFA檢測方法的可重復(fù)性。利用建立的IFA檢測方法和兔體熱反應(yīng)分別檢測20批豬瘟傳代細(xì)胞源活疫苗半成品

8、疫苗的抗原含量，分析IFA與兔體效力檢測結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，兔體定型熱反應(yīng)(RID)與IFA具一定對應(yīng)關(guān)系。當(dāng)兔體效力檢測每毫升病毒培養(yǎng)液中含病毒≥10萬RID時(shí)，IFA檢測病毒液抗原含量在103.6TCID50/ml～104.25TCID50/ml之間;當(dāng)每毫升病毒培養(yǎng)液含病毒≥50萬RID以上時(shí)，IFA檢測病毒液抗原含量位于104.5TCID50/ml～106.5TCID50/ml之間。因此，若要每毫升病毒培養(yǎng)液中抗原含量達(dá)到

9、50萬RID以上，IFA檢測其病毒含量不得少于104.5TCID50/ml。因此，可以通過檢測豬瘟活疫苗半成品的TCID50，為生產(chǎn)車間定量精準(zhǔn)配苗提供依據(jù)。
　　3.豬瘟病毒E2蛋白亞單位疫苗的初步研制
　　用純化的E2蛋白(3.4mg/ml)與佐劑乳化制備了三批豬瘟E2蛋白的水包油型亞單位疫苗，物理性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)均符合規(guī)定。安全檢驗(yàn)結(jié)果表明，接種豬均表現(xiàn)精神狀態(tài)、飲食欲正常，發(fā)育良好，未見任何全身和注射局部不良反應(yīng)。

10、隨機(jī)挑取一個(gè)批次的疫苗，進(jìn)行疫苗的免疫效力比較實(shí)驗(yàn)。活疫苗免疫組和亞單位疫苗免疫組在二免后14天，連同對照組同時(shí)用豬瘟石門系強(qiáng)毒攻擊。結(jié)果兩個(gè)免疫組豬攻毒后精神食欲狀態(tài)良好，體溫也沒有明顯波動(dòng)，未出現(xiàn)豬瘟相關(guān)臨床癥狀和各臟器的病理損傷，表明免疫豬可抵抗致死量豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。對照組豬在攻毒后第9天開始死亡，死亡豬出現(xiàn)典型豬瘟敗血癥癥狀。試驗(yàn)豬免疫后不同時(shí)間采血，ELISA檢測試劑盒檢測抗體效價(jià)。兩種類型疫苗一免后14天抗體均轉(zhuǎn)陽，一免后2

11、1天抗體繼續(xù)上升;二免后抗體繼續(xù)上升。其中，一免后活苗比亞單位苗免疫組豬抗體上升速度快，而二免后亞單位苗抗體上升速度較快。試驗(yàn)期內(nèi)對照組豬抗體一直為陰性。熒光定量RT-PCR檢測肺門淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)及扁桃體中的豬瘟病毒載量。對照組豬的肺門淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)及扁桃體中病毒含量比較多，而免疫組豬三個(gè)組織的病毒含量均較低，其中亞單位苗免疫組比活苗免疫組豬病毒含量低，表明免疫E2蛋白亞單位疫苗后，豬組織的帶毒量更少，豬只更健康，可作為豬瘟