豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗效檢替代方法和豬瘟病毒鑒別檢測方法的建立.pdf

1、豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接觸性、多系統(tǒng)出血性豬傳染病。我國對于豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗大規(guī)模免疫為主。但是點狀散發(fā)的豬瘟疫情仍時有發(fā)生，并且在我國分布廣泛，流行態(tài)勢日趨復(fù)雜。
　　 在這種情況下需要對疫苗免疫和野毒感染動物進(jìn)行鑒別檢測，調(diào)查豬場中豬瘟隱性感染或持續(xù)性感染的情況，同時通過一定的方法提高

2、豬瘟兔化弱毒疫苗的質(zhì)量。本研究旨在建立豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗的效檢替代方法以及對豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測方法，為我國豬瘟的防控工作提供幫助。(1)以兔體定型熱法進(jìn)行豬瘟疫苗效檢受試驗兔個體差異和飼養(yǎng)環(huán)境的影響很大。本研究將待檢疫苗系列稀釋后接種易感細(xì)胞，使用RT-nestPCR、RT-PCR和抗原捕獲ELISA三種方法檢測細(xì)胞感染后產(chǎn)生的子代病毒。不同疫苗所能夠檢測到的陽性稀釋度的高低可以反映疫苗中的有

3、感染性病毒粒子的濃度，以最高陽性稀釋度作為疫苗效價的指標(biāo)。使用該方法對12批豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗和3批豬瘟兔化弱毒牛睪丸疫苗進(jìn)行效檢并與兔體定型熱法效檢的結(jié)果進(jìn)行比對。結(jié)果表明，ST傳代細(xì)胞源疫苗的陽性稀釋度達(dá)到10-6～10-7，每頭份含2.6×104～3.0×104 RID。牛睪丸疫苗的陽性稀釋度≤10-4，每頭份含7.0×103～8.0×103 RID，本方法效檢的結(jié)果與兔體定型熱法存在一定的相關(guān)性，并且能夠反映疫苗中有

4、感染性病毒粒子的多少。(2)在豬瘟兔化弱毒基因組3'端12nt多聚T堿基插入?yún)^(qū)域兩側(cè)的保守區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計一對外圍引物和一對內(nèi)圍引物。豬瘟兔化弱毒的擴增片段因包含有多聚T堿基插入片段所以要長于豬瘟野毒的擴增片段。RT-nestPCR方法對于豬瘟兔化弱毒C株和豬瘟石門毒的檢測極限分別為0.032pg和0.045pg病毒RNA。特異性試驗的檢測結(jié)果顯示，該方法能夠有效檢測各類型的豬瘟病毒，對非豬瘟的其它病原的檢測結(jié)果均為陰性。對400份健康豬

5、扁桃體臨床樣本進(jìn)行檢測得到4份豬瘟兔化弱毒和12份豬瘟野毒陽性樣本。對14批豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測表明所有疫苗均可檢測到豬瘟兔化弱毒并且未發(fā)現(xiàn)存在豬瘟野毒污染。所建立的RT-nestPCR鑒別檢測方法能夠有效區(qū)分豬瘟兔化弱毒和豬瘟野毒，特異性好、靈敏度高。(3)通過對47條豬瘟病毒、7條牛病毒性腹瀉病毒和3條邊界病毒基因組全序列比對，分別在豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV基因組保守區(qū)域設(shè)計了3條TaqMan-MGB探針和配套引物。采用正

6、交試驗設(shè)計對上、下游引物濃度、探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。特異性試驗表明該方法在同時鑒別檢測豬瘟兔化弱毒、不同基因型的豬瘟野毒和BVDV時均能在相應(yīng)熒光通道觀察到特異性擴增曲線，各通道間無熒光干擾，對其它病毒的檢測則無擴增曲線。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不大于1％。敏感性試驗表明該方法對豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒Shimen株、BVDV_Oregon株的檢測極限分別為31.4拷貝/μL、15.8拷貝/μL、32.5拷貝/μL。

7、對400份臨床組織樣本檢測得到4份豬瘟兔化弱毒陽性、12份豬瘟野毒陽性、22份BVDV陽性，對14批商品化豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測表明均能檢測到豬瘟兔化弱毒，并且無豬瘟野毒和BVDV污染，與其它檢測方法的符合率達(dá)到95％以上。本方法可以同時定量檢測和區(qū)分豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV，可以用于區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動物，同時還可以對豬瘟疫苗的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。(4)為了對我國種豬場內(nèi)豬瘟病毒的隱性感染情況進(jìn)行了調(diào)查。對采集自中國北方部分地區(qū)

8、種豬場臨床健康豬的400份扁桃體進(jìn)行檢測并對豬瘟野毒陽性樣本進(jìn)行病毒分離，成功得到11株豬瘟病毒分離株?；贓2全基因序列的遺傳進(jìn)化分析表明這11株豬瘟病毒全部屬于2.1a亞型。推導(dǎo)氨基酸序列的分析表明，這11株病毒在E2蛋白抗原結(jié)構(gòu)域中的部分位點發(fā)生了一致的、與其它豬瘟病毒分離株都不同的變異。
　　 本研究通過所建立的RT-nestPCR和三重?zé)晒舛縍T-PCR鑒別檢測方法對我國北方地區(qū)種豬場內(nèi)豬瘟病毒隱性感染進(jìn)行了調(diào)查，并