比較豬瘟病毒兔化毒株和石門株5端非編碼區(qū)對病毒翻譯的影響.pdf

1、豬瘟是豬的重要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界衛(wèi)生組織列為A類動物烈性傳染病之一，加強(qiáng)對豬瘟病毒研究顯得尤為重要?？刂曝i瘟最有效的方法是注射疫苗，目前最常用的疫苗為減毒疫苗。中國C株在我國控制豬瘟傳播上發(fā)揮重要作用，并被國外廣泛應(yīng)用，是公認(rèn)的安全有效的疫苗。
　　豬瘟病毒全基因組包括5端和3端非編碼區(qū)，中間是一個大的閱讀框，編碼12種蛋白。5端非編碼區(qū)包含一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，通過與宿主核糖體的配對，起

2、始病毒的翻譯。豬瘟病毒中國C株在豬細(xì)胞中的復(fù)制效率很低，其原因可能很復(fù)雜，具體機(jī)制尚不清楚，我們推測病毒滴度的高低與其翻譯水平有一定的聯(lián)系，而豬瘟病毒決定翻譯的主要是5端非編碼區(qū)上的IRES，因此我們比較石門株和C株對病毒翻譯的影響。本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pEGFP-N3-FR，包含巨細(xì)胞病毒CMV強(qiáng)啟動子控制下的Rluc報告基因及CSFV S株的IRES控制下的Fluc報告基因，以弱毒C株IRES取代強(qiáng)毒Shimen株的IRES，獲得重組

3、質(zhì)粒pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR。通過比較二者調(diào)控下的熒光素酶報告基因的表達(dá)情況，了解IRES對C株病毒翻譯的影響。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組pEGFP-N3-FR及pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR的螢火蟲熒光素酶活性差異不顯著，表明兔化毒株的低翻譯效率可能不是IRES差異造成的。
　　豬瘟病毒反向遺傳系統(tǒng)目前主要的方法還是體外轉(zhuǎn)錄，即轉(zhuǎn)錄由啟動子起始，轉(zhuǎn)錄過程由終止子終止，產(chǎn)物mRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中翻譯蛋白。但由于產(chǎn)生的R

4、NA易降解，不利于轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。本研究設(shè)計(jì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，避免了體外轉(zhuǎn)錄的操作。T7 RNA聚合酶能嚴(yán)格、特異地識別T7啟動子，高效轉(zhuǎn)錄mRNA。本研究是以E coli.BL21基因組為模板，通過PCR獲得T7 RNA聚合酶基因，經(jīng)測序確定無移碼突變后，最終克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N3啟動子CMV的下游，獲得含T7 RNA聚合酶的真核表達(dá)載體。并與含T7啟動子控制下的的重組質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染

5、到豬腎細(xì)胞PK-15中，通過檢測GFP基因的表達(dá)情況，確定T7 RNA聚合酶的偶聯(lián)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目較低，可見視野內(nèi)僅有幾個細(xì)胞表達(dá)，已經(jīng)證明T7 RNA聚合酶的偶聯(lián)表達(dá)，建立T7 RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)，為下一步CSFV體內(nèi)轉(zhuǎn)錄打下基礎(chǔ)。
　　質(zhì)粒的穩(wěn)定性包括分離的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。重組質(zhì)粒在傳代的過程中由于受外界條件的影響，易發(fā)生基因序列的突變，甚至是質(zhì)粒的丟失。提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性在遺傳工程研究和生產(chǎn)中顯

6、得很重要。本研究將質(zhì)粒pMC18-CSFV-C株全基因進(jìn)行測序，與我們實(shí)驗(yàn)室以前測得的序列AY382481比對后，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上C株cDNA有若干個位點(diǎn)發(fā)生突變。說明質(zhì)粒在保存及擴(kuò)增的過程中發(fā)生了一定程度的突變。
　　為了控制豬瘟的傳播，了解全國乃至世界豬瘟的進(jìn)化情況，掌握豬瘟流行的種群動態(tài)，對預(yù)防豬瘟有著不可替代的作用。另外，疫苗接種對預(yù)防豬瘟傳播起了重要作用，但疫苗接種對豬瘟病毒群體進(jìn)化的影響尚沒有相關(guān)報道。本研究收集中國可利用的