豬瘟兔化弱毒（C株）和雞馬立克火雞皰疹病毒（HVT）病毒保護(hù)劑的研究.pdf

1、第一部分 豬瘟兔化弱毒(C株)病毒保護(hù)劑的研究該試驗(yàn)將6種病毒保護(hù)劑基質(zhì)運(yùn)用于PK15細(xì)胞,雞胚成纖維細(xì)胞,帶毒牛睪丸細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)時(shí)觀察法篩選出一種病毒保護(hù)劑Ⅰ,并確定其工作濃度為10％.通過建立PK15細(xì)胞、豬瘟Thiveosal株及病毒保護(hù)劑三者相互關(guān)系模型,為提高豬瘟細(xì)胞疫苗的效價(jià)構(gòu)建理論規(guī)律.首先,我們運(yùn)用常規(guī)細(xì)胞實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)法,建立PK15細(xì)胞增殖曲線和帶毒PK15細(xì)胞的增殖曲線,發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒對(duì)PK15細(xì)胞不但不產(chǎn)生細(xì)胞

2、病變,反而促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖,在48小時(shí)細(xì)胞生長的對(duì)數(shù)期,帶毒的PK15細(xì)胞的分裂增殖數(shù)是未帶毒細(xì)胞的131.5％.運(yùn)用直接免疫熒光法篩選出最佳細(xì)胞密度、最佳接毒量及最佳接毒方式的產(chǎn)毒模型.建立了常規(guī)對(duì)照組(未加病毒保護(hù)劑)的病毒增殖曲線和加入病毒保護(hù)劑的病毒增殖曲線,從兩者對(duì)比結(jié)果看,直接免疫熒光檢測(cè)病毒保護(hù)劑增殖病毒的結(jié)果并不明顯,但相同滴度下加入病毒保護(hù)劑組測(cè)得熒光斑較亮且致密.進(jìn)一步運(yùn)用活細(xì)胞染色排除法證明病毒保護(hù)劑具有提高帶毒

3、細(xì)胞數(shù)量的功能.同樣原始的細(xì)胞經(jīng)過60h后,試驗(yàn)組的帶毒活細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的1.22倍,而活細(xì)胞比率基本一致.運(yùn)用MTT活力測(cè)定同樣驗(yàn)證了試驗(yàn)組活細(xì)胞增幅優(yōu)于對(duì)照組.生產(chǎn)應(yīng)用中提取的樣品病毒蛋白濃度測(cè)定表明試驗(yàn)組的病毒濃度比對(duì)照組提高22％.病毒保護(hù)劑運(yùn)用于豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞毒疫苗生產(chǎn)中,發(fā)現(xiàn)20％的病毒保護(hù)劑對(duì)產(chǎn)毒有輕微損傷作用,10％的病毒保護(hù)劑測(cè)毒的兔體熱型反應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)是對(duì)照組的兩倍.試驗(yàn)組和對(duì)照組的反復(fù)凍融試驗(yàn)表明對(duì)照組反復(fù)凍融

4、6次即為臨界點(diǎn),超過6次即達(dá)不到配苗的要求,而加入病毒保護(hù)劑后反復(fù)凍融10次,也能達(dá)到配苗的要求.冷凍保存期試驗(yàn)表明對(duì)照組保存3月合格,而病毒保護(hù)劑組可保存到5個(gè)月合格.37℃熱試驗(yàn)表明對(duì)照組置37℃8小時(shí)合格,而病毒保護(hù)劑組置37℃10小時(shí)達(dá)到合格.通過細(xì)胞毒電鏡觀察及主要保護(hù)性抗原基因E2、E0測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明:病毒保護(hù)劑不影響病毒粒子形態(tài)的變化,且不產(chǎn)生基因突變.抗體水平檢測(cè)和免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明:病毒保護(hù)劑能刺激機(jī)體早期中和抗體

5、的產(chǎn)生,且免疫保護(hù)力堅(jiān)強(qiáng).第二部分 雞馬立克氏病火雞皰疹病毒(HVT)病毒保護(hù)劑的研究該試驗(yàn)配制兩種不同的病毒保劑A和B,應(yīng)用于HVT活疫苗生產(chǎn)中,進(jìn)行3批試驗(yàn),結(jié)果表明:B蝕斑數(shù)比對(duì)照平均增加121％,A至少減少14％,說明病毒保護(hù)劑B具有一定的促進(jìn)病毒增殖的功能.病毒保護(hù)劑B進(jìn)行最佳添加濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果表明合適的添加濃度:1次細(xì)胞為1％或2％,2次細(xì)胞工作濃度為2％.病毒保護(hù)劑B擴(kuò)大中試試驗(yàn),進(jìn)行3批,結(jié)果表明:裂前1萬倍稀釋,保護(hù)

6、劑組比對(duì)照組蝕斑數(shù)平均增幅達(dá)143％;裂后4萬倍稀釋,保護(hù)劑組比對(duì)照組蝕斑數(shù)增幅平均可達(dá)66.5％.馬立克HVT活疫苗(病毒保護(hù)劑)特異性試驗(yàn)表明,馬立克標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的HVT活疫苗(含保護(hù)劑B)特異性識(shí)別,含有病毒保護(hù)劑不改變HVT的抗原性.馬立克HVT活疫苗(病毒保護(hù)劑B)和常規(guī)對(duì)照苗耐熱對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明:平行凍干一批疫苗,批號(hào)為:200401,試驗(yàn)組比對(duì)照組蝕斑數(shù)高200％;經(jīng)37℃10天耐熱試驗(yàn),試驗(yàn)組比對(duì)照組蝕斑數(shù)高242％.試