同時檢測和區(qū)分豬瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹瀉病毒1型的三重熒光定量RT-PCR方法的建立.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(HCV或CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入OIE名錄，我國將其列為一類傳染病。其基因組為單股正鏈RNA，大小約為12.3 kb，含有1個大的開放閱讀框(ORF)，兩側(cè)為高度保守的5'和3'非編碼區(qū)(UTR)。
　　 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和CSFV同為黃病毒科瘟病毒屬成員，根據(jù)BVD

2、V基因組的差異，我們將其分為兩個基因型，即基因型1(BVDV-1)和基因型2(BVDV-2)。同屬的成員還包括：綿羊邊界病病毒(BDV)和長頸鹿瘟病毒(Pestivirus of Giraffe)。由于BVDV不僅可以感染牛還可以感染豬，引起與豬瘟相似的臨床癥狀和病理變化，同時BVDV與CSFV存在血清學交叉反應，因此很容易被誤診為豬瘟。此外，豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我國的大規(guī)模應用，使豬瘟野毒感染、疫苗接種的區(qū)分變得非常困難和必

3、要。因此，亟待建立一種可以準確區(qū)分豬瘟野毒感染、疫苗接種以及BVDV感染的快速、高效、敏感而特異的檢測方法。
　　 本研究旨在建立一種能同時區(qū)分CSFV野毒、HCLV和BVDV-1的敏感、特異、重復性好的三重熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法。根據(jù)CSFV NS5B區(qū)域分別設(shè)計了針對CSFV野毒、HCLV的引物和TaqMan水解探針，依據(jù)BVDV5'-UTR設(shè)計了一對針對BVDV-1的引物和TaqMan水解探針，在優(yōu)化反應條件的基

4、礎(chǔ)上，建立了同時區(qū)分CSFV、HCLV和BVDV-1的三重熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法能將我國大陸流行的不同基因亞群的CSFV野毒株、HCLV以及BVDV-1完全區(qū)分開來，而不與其它豬源病毒發(fā)生非特異反應，在107-101拷貝/μL范圍內(nèi)，對CSFV、HCLV和BVDV標準品模板的檢測具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限分別為4.5 TCID50(CSFV野毒)、7.8個拷貝(HCLV)或3.2 TCID50(BVDV-1)。用