豬瘟兔化弱毒疫苗株熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬瘟( Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。豬瘟在世界上許多養(yǎng)豬國家有不同程度流行，OIE將其規(guī)定為必須申報的動物傳染病之一。
　　 目前，疫苗接種是控制豬瘟的一種重要手段。中國創(chuàng)制的疫苗株-豬瘟兔化弱毒(HCLV，簡稱C株)，因其安全有效，已被許多國家所使用。由于HCLV不能致細(xì)胞病變，確定其毒

2、價一直采用兔體定型熱反應(yīng)法，由于該方法不僅不能準(zhǔn)確定量，而且試驗繁瑣、周期長、且結(jié)果易受個體差異的影響，不適合于大批樣品的檢測。因此，如何快速而準(zhǔn)確地測定疫苗株毒價是豬瘟疫苗生產(chǎn)中的一大難題。
　　 本研究旨在建立一種用于定量檢測疫苗中豬瘟病毒含量的熒光定量RT-PCR方法。研究中以HCLV EO基因序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計一對特異性引物和一條TaqMan探針，以病毒RNA為模板，通過條件篩選與優(yōu)化建立了熒光定量RT-PCR方法。該方法

3、檢測靈敏度可達(dá)3.84拷貝/μL;具有高度特異性，分別以豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，未出現(xiàn)陽性信號；試驗組內(nèi)變異系數(shù)1.05％～1.84％，組間變異系數(shù)為3.70％～5.43％。
　　 應(yīng)用所建立的熒光定量RT-PCR方法對32個不同批次的豬瘟兔化弱毒疫苗懸液、9個批次的豬瘟細(xì)胞疫苗和183個批次的豬瘟脾淋苗進(jìn)行定量檢測。同

4、時，將豬瘟兔化弱毒疫苗懸液10萬倍稀釋后進(jìn)行兔體反應(yīng)熱試驗。試驗結(jié)果表明疫苗頭份數(shù)、兔體反應(yīng)熱與其所含病毒粒子數(shù)之間具有較好的相關(guān)性，即頭份數(shù)越高，病毒粒子數(shù)越多。
　　 應(yīng)用所建立的熒光定量RT-PCR方法對2個批次中3個收次共24個時間段的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。結(jié)果表明從一收到三收每個收次中病毒含量隨時間增加而增加，直至第96小時收毒達(dá)到最高，且在換液后病毒滴度顯著下降，后又逐漸增加。
　　 本研究所建立的熒光定量RT