G9型豬輪狀病毒TaqMan熒光定量Rt-PCR檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)成員，是病毒性腹瀉的主要病原，多感染嬰幼兒及多種幼齡動物。對于仔豬來說，輪狀病毒的致病力極高，特別是7日齡以內(nèi)的仔豬，死亡率接近100％。輪狀病毒的潛伏期短，傳染性強，一旦有豬只感染，則會迅速傳播，引起輪狀病毒的大規(guī)模暴發(fā)，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。現(xiàn)階段對于輪狀病毒的檢測主要依靠常規(guī)RT-PCR方法，但該方法靈敏性較低，較難用于早期診斷和微量檢測。而熒

2、光定量RT-PCR方法恰好彌補了這一缺陷，一般來說，定量RT-PCR方法較常規(guī)RT-PCR方法敏感性高約100-1000倍，適應于感染早期的微量診斷，為及早防控輪狀病毒的暴發(fā)并將損失降到最低提供科學數(shù)據(jù)。
　　本試驗旨在建立一種靈敏、特異的G9型豬輪狀病毒(PoRV) TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，為輪狀病毒的臨床診斷提供有效的技術(shù)手段。根據(jù)GenBank中登錄的PoRV（G9型）NMTL株的VP7基因保守區(qū)域設計了特

3、異的引物和探針。通過對引物探針使用濃度、退火溫度等條件進行優(yōu)化，以常規(guī)RT-PCR擴增的VP7基因片段與pMD18-T載體進行連接構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒進行10倍系列稀釋作為標準品，建立了G9型輪狀病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，并評價了該方法的特異性、靈敏性和重復性。通過建立標準曲線，可知初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值之間呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，直線方程為Y=-3.436X+41.70，相關(guān)系數(shù)達到0.991。此方法可檢測的最低濃

4、度為33.6copies/μL，與常規(guī)RT-PCR檢測方法相比，靈敏度高約1000倍。該方法對其它常見的PoRV(G5)、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒2型等豬病病原檢測均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。研究結(jié)果表明，該方法具有特異性好、靈敏度高、重復性好的優(yōu)點，可以對輪狀病毒感染早期豬只體內(nèi)的輪狀病毒做出準確的判斷和定量，進而對預防輪狀病毒的大規(guī)模爆發(fā)起到了重要的作用。
　　用PoRV NMTL

5、分離株對3日齡健康新生仔豬進行攻毒試驗，此毒株的TCID50為10-4.5/0.1mL。選取8頭仔豬，將其分為攻毒組和對照組，每組4頭，攻毒組口服5×105 TCID50病毒細胞培養(yǎng)液，將攻毒組與對照組分開飼養(yǎng)。研究結(jié)果顯示，攻毒后8h有一頭仔豬發(fā)生腹瀉癥狀，隨著時間的推移，出現(xiàn)腹瀉的仔豬數(shù)量增加，表現(xiàn)為嘔吐、脫水、消瘦等癥狀，糞便為黃色水樣，精神萎靡。最早死亡的仔豬是在攻毒后36h，死亡時脫水癥狀明顯，身體呈現(xiàn)紫青色。利用建立的G9型

6、豬輪狀病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法檢測攻毒后每12h采集的肛拭子樣品，結(jié)果表明，隨著攻毒時間的增加病毒拷貝數(shù)也在不斷增加，在攻毒后60h-84h病毒拷貝數(shù)達到最高值。病理組織學分析發(fā)現(xiàn)攻毒組仔豬的小腸出現(xiàn)嚴重的病變:十二指腸、空腸、回腸都有明顯的萎縮變粗;絨毛上皮細胞壞死、脫落;絨毛近黏膜處黏膜上皮細胞空泡化;固有層出現(xiàn)水腫，而對照組仔豬沒有明顯的病理變化。
　　本研究為輪狀病毒的臨床診斷工作提供了有效的技術(shù)支持，