坦布蘇病毒的分離鑒定及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、坦布蘇病毒感染是由坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋量下降和雛鴨神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染性疾病。主要表現(xiàn)為發(fā)生迅速、流行范圍廣、傳播速度快、發(fā)病率和死亡率都較高，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，加強(qiáng)該病的研究對(duì)保護(hù)和促進(jìn)我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
　　 TMUV感染于2010年由曹貞貞、張大丙首次報(bào)道，之后在我國的大部分養(yǎng)鴨地區(qū)流行。建立精確、快速的檢測方法是控制TMUV的有效措施。本研究從發(fā)病

2、雛鴨腦內(nèi)分離到一株TMUV，并對(duì)該病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究;建立了熒光定量PCR的檢測方法，利用建立的方法對(duì)雛鴨和蛋雞不同組織器官中的TMUV分布情況進(jìn)行了檢測，從而為TMUV致病機(jī)理的研究提供理論依據(jù)
　　 一、坦布蘇病毒SDLZ株的分離鑒定
　　 通過鴨胚尿囊腔接種，從疑似TMUV感染的病料組織中分離得到一株病毒，通過RT-PCR方法和動(dòng)物回歸試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，并對(duì)該毒株的培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究。分離毒株RT-PC

3、R鑒定結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物與設(shè)計(jì)引物預(yù)期產(chǎn)物大小一致，克隆測序結(jié)果與GenBank中的TMUV相應(yīng)片段的核苷酸同源性均為100％。分離毒株人工感染雛鴨后的癥狀及病理變化與自然感染的病例相同;鴨胚半數(shù)致死量DELD50為10-4.5/0.2mL;該毒株可在雞胚、鴨胚、鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)、非洲(綠)猴細(xì)胞(Vero)中培養(yǎng)增殖，并引起胚體和細(xì)胞病變。上述結(jié)果表明，分離毒株為TMUV，命名為SDLZ株。
　　 二、坦布蘇病毒熒光

4、定量PCR快速檢測方法的建立與應(yīng)用
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測定的一株TMUV全基因序列（SDLZ株），選擇該序列的E基因和NS5基因作為病毒蛋白基因，分別在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成特異性引物，擴(kuò)增長度為225bp和264 bp的目的片段。以β-actin肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因，擴(kuò)增長度為139 bp的目的片段。將PCR擴(kuò)增的的片段分別連接到pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)篩選、鑒定純化后，倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR中

5、NS5、E基因及內(nèi)參基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，建立檢測坦布蘇病毒的相對(duì)熒光定量RT-PCR方法。研究結(jié)果表明，構(gòu)建的熒光定量PCR檢測方法檢測10倍梯度稀釋的β-actin、NS5和E質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，最小檢出模板濃度約為10 Copies/μL，E基因、NS5基因和β-actin基因的Ct值與陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均成良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系R2值均在0.99以上;特異性結(jié)果表明，E基因、NS5基因和β-actin基因的熔解曲

6、線單一，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體;重復(fù)性結(jié)果顯示，E基因、NS5基因和β-actin基因的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于0.5％。本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以用于TMUV早期檢測，以便于早發(fā)現(xiàn)，以及時(shí)采取相應(yīng)的防治措施，減少TMUV感染對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成的危害。
　　 三、坦布蘇病毒在雛鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律
　　 將純化的TMUV人工感染3日齡雛鴨

7、，定期剖殺攻毒組和對(duì)照組雛鴨，用建立的熒光定量PCR方法對(duì)各組織病料進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:試驗(yàn)組雛鴨人工感染3d后可在各個(gè)組織中檢測到TMUV，感染后7d在各組織中的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，感染15 d天仍能在各組織中檢測到病毒。TMUV相對(duì)表達(dá)量最高的器官為胰臟、腦、心臟，相對(duì)表達(dá)量在0.5～0.8之間，表明這些器官是TMUV感染后的主要靶器官。其次為肝臟、脾臟，相對(duì)表達(dá)量在0.4～0.6之間。表達(dá)量較低的為法氏囊和肺臟，相對(duì)表達(dá)量在0.2

8、～0.4之間
　　 四、坦布蘇病毒在蛋雞體內(nèi)的分布規(guī)律
　　 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法檢測TMUV感染產(chǎn)蛋雞不同組織在不同時(shí)間段TMUV的相對(duì)表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示:攻毒后3d在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰臟、卵泡、輸卵管中均可檢測到坦布蘇病毒，各組織TMUV的相對(duì)表達(dá)量都較高，其中卵泡和輸卵管最高;攻毒后5d肝臟、脾臟、肺臟、胰臟的病毒含量減少，卵泡和輸卵管含量沒有變化;攻毒后9d，只在卵泡中檢測到病毒。坦布蘇病毒相