坦布蘇病毒AH-F10株E蛋白的原核表達(dá)及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒（Tembusu virus）引起的，該病能導(dǎo)致蛋鴨的產(chǎn)蛋下降、生長(zhǎng)遲緩以及死亡，同時(shí)該病毒對(duì)肉鴨及蛋鴨都有致病力，鴨子感染后，臨床出現(xiàn)高熱、沉郁、厭食等癥狀；蛋鴨、種鴨的產(chǎn)蛋量開(kāi)始下降而且下降比較迅速直到蛋鴨、種鴨不產(chǎn)蛋；肉鴨出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩。坦布蘇病毒病的發(fā)病率最高可以達(dá)100％，死亡率在5%-10%之間。坦布蘇病毒的E蛋白含有病毒的抗原決定簇，構(gòu)成坦布蘇病毒的主要抗原表為，而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主細(xì)胞

2、的過(guò)程中都起著重要的作用。
　　本研究用RT-PCR檢測(cè)方法來(lái)擴(kuò)增Tembusu的E基因，然后連接到原核表達(dá)載體pET-32a（+），轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細(xì)胞能成功表達(dá)重組蛋白His-E。蛋白大小為54kDa，表達(dá)的產(chǎn)物以存在與沉淀中，具體是在包涵體中。Western blot結(jié)果表明目的蛋白可與坦布蘇病毒鴨的陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。利用包涵體粗純化的方法得到的高純度的重組蛋白，用紫外分光吸

3、收法測(cè)定其濃度為2.978g/L。對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行乳化，乳化的方法是與弗氏佐劑等體積震蕩，然后每只BALB/c小鼠注射0.2mg重組蛋白的劑量，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，每隔兩周免疫一次，3免后，可加強(qiáng)免疫，眼眶取血，分離血清。以該血清作為一抗開(kāi)展IFA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，坦布蘇病毒在感染BHK-21細(xì)胞36h后，用倒置熒光顯微鏡可以看到實(shí)驗(yàn)孔有特異性的綠色熒光，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)綠色熒光，表明表達(dá)純化的E蛋白具有良好的免疫原性。
　　

4、根據(jù)Tembusu virus E基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，對(duì)E基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后將純化回收的產(chǎn)物連接到 pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-19-E。然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板建立SYBR-Green1實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和重復(fù)性檢測(cè)。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后，建立的坦布蘇病毒的SYBR-Green1熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的

5、線性關(guān)系R2均在0.99以上，平均試驗(yàn)間變異系數(shù)為0.26%；檢測(cè)敏感性可達(dá)到2×101copies/μL。應(yīng)用該方法對(duì)人工感染坦布蘇病毒的麻鴨的腦、脾臟、肝臟、胰腺，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果從36份病料組織中檢出35份為陽(yáng)性，檢出率為97%，而常規(guī)PCR的檢出率為42%。結(jié)果表明，成功建立了檢測(cè)坦布蘇病毒的SYBR-Green1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，該方法較常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法更快捷，敏感，準(zhǔn)確，適用于坦布蘇病毒臨床樣