人多瘤病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及臨床研究.pdf

1、應(yīng)用巢式 PCR和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)人類多瘤病毒 KIPyV和WUPyV基因，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，比較兩種檢測(cè)方法，以期建立一種快速、特異、靈敏的標(biāo)準(zhǔn) SOP；建立靈敏性高，可重復(fù)性、特異性好的SV40、JCV、BKV、MCPyV、HPyV6、HPyV7、TSPyV、HPyV9的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法，并初步應(yīng)用于200例北京地區(qū)呼吸道感染兒童的NPA（Nasopharyngea A

2、spirates）檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。同時(shí)，了解北京地區(qū)急性呼吸道感染患兒的人多瘤病毒感染狀況。為疾病的預(yù)防與控制提供基礎(chǔ)的科研資料。結(jié)果顯示：KIPyV和WUPyV巢式 PCR的檢測(cè)靈敏性為500copies/μL，檢測(cè)其他呼吸道病毒沒有陽性擴(kuò)增，說明特異性較好。TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR在靈敏性為1～10copies/μL，檢測(cè)范圍為100～1010copies/μL，R2大于等于0.99，說明線性相關(guān)性良好?？?/p>

3、重復(fù)性檢測(cè) KIPyV和WUPyV的CV值分別均小于2.9％和1.95%，特異性檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)其他病毒時(shí)沒有出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線。以不同濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按既定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度 JCV可達(dá)10 copies/μL，MCPyV可達(dá)1 copies/μL，HPyV6可達(dá)1 copies/μL，線性范圍可達(dá) JCV101～1010copies/μL，MCPyV和HPyV6100～1010copie

4、s/μL陰性對(duì)照無特異性擴(kuò)增信號(hào)。R2均大于0.99，說明線性良好。可重復(fù)性檢測(cè) MCPyV、JCV、HPyV6的CV值分別均小于0.79%、0.62%、0.67%，特異性檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)其他病毒時(shí)沒有出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線。在檢出的5種多瘤病毒的序列與 NCBI的序列的同源性在98%-100%。本研究對(duì)北京地區(qū)急性呼吸道感染兒童標(biāo)本進(jìn)行了探索性基因檢測(cè)和基因分析，證實(shí)了該地區(qū)呼吸道感染患兒中存在至少存在1種早前發(fā)現(xiàn)的人多瘤病毒 JCV和至少有4

5、種新的人多瘤病毒 KIPyV WUPyV、MCPyV、HPyV6的感染。200例急性呼吸道感染兒童中 JCV、KIPyV、WUPyV、MCPyV、HPyV6的陽性檢出率分別為0.5％、12%、14％、9%、0.5%。本研究初步建立了一種靈敏性、可重復(fù)性好、特異性高的快速核酸檢測(cè)方法，其在臨床上有較好的應(yīng)用前景。2011年10月到2012年1月秋冬季，感染人多瘤病毒 KIPyV、WUPyV、MCPyV主要發(fā)生在11月下旬到12月中旬。 K

6、IPyV、 WUPyV、MCPyV感染病例主要是3歲以下兒童，性別無明顯差異。KIPyV、WUPyV、MCPyV、JCV、HPyV6感染兒童的臨床診斷包括小葉性支氣管炎、急性支氣管肺炎，支氣管肺炎、新生兒肺炎、急性腸胃炎、川崎病、呼吸道合胞病毒肺炎，小葉性支氣管炎居多。KIPyV混合感染率為54%(13/24)，WUPyV混合感染率為41%(15/28)。MCPyV混合感染率為67%(12/18)，混合感染 RSV的為47%(29/62